M-MLV ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್
ರೆವ್‌ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಅನ್ನು ಜೆನೆಟಿಕ್ ಎಂಜಿನಿಯರಿಂಗ್ ತಂತ್ರಜ್ಞಾನದಿಂದ ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ.ಇದು ಹೆಚ್ಚಿನ cDNA ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆ ಸಾಮರ್ಥ್ಯ, ಉಷ್ಣ ಸ್ಥಿರತೆ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ತಾಪಮಾನ ಮಿತಿ (60 ° C ವರೆಗೆ) ಹೊಂದಿದೆ.ಸಂಶ್ಲೇಷಿತ cDNA ಉತ್ಪನ್ನವು 10 kb ವರೆಗೆ ಇರುತ್ತದೆ.ಇದು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳ ಬಾಂಧವ್ಯವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಸಂಕೀರ್ಣವಾದ ದ್ವಿತೀಯಕ ರಚನೆ ಅಥವಾ ಕಡಿಮೆ ನಕಲು ಜೀನ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಆರ್ಎನ್ಎ ಟೆಂಪ್ಲೆಟ್‌ಗಳ ಹಿಮ್ಮುಖ ಪ್ರತಿಲೇಖನಕ್ಕೆ ಸೂಕ್ತವಾಗಿದೆ.
ಘಟಕಗಳು
| ಘಟಕ | HC2003 ಬಿ (10,000U) | HC2003 ಬಿ (5*10,000U) | HC2003 ಬಿ (200,000U) |
| RevScript ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ (200U/μL) | 50 μL | 5×50 μL | 1 ಮಿ.ಲೀ |
| 5 × ರೆವ್‌ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟ್ ಬಫರ್ | 250 μL | 1.25 ಮಿ.ಲೀ | 5 ಮಿ.ಲೀ |
ಶೇಖರಣಾ ಸ್ಥಿತಿ
ಈ ಉತ್ಪನ್ನವನ್ನು 2 ವರ್ಷಗಳವರೆಗೆ -25 ° C~-15 ° C ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಬೇಕು.
ಘಟಕದ ವ್ಯಾಖ್ಯಾನ
ಒಂದು ಘಟಕವು 1 nmol dTTP ಅನ್ನು ಆಮ್ಲ-ಕರಗದ ವಸ್ತುವಾಗಿ 10 ನಿಮಿಷಗಳಲ್ಲಿ 37 ° C ನಲ್ಲಿ ಒಲಿಗೊ (dT) ಅನ್ನು ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳಾಗಿ ಬಳಸುತ್ತದೆ.
ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಸೆಟಪ್
1.ಆರ್ಎನ್ಎ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನ ಡಿನಾಟರೇಶನ್ (ಈ ಹಂತವು ಐಚ್ಛಿಕವಾಗಿರುತ್ತದೆ, ಆರ್ಎನ್ಎ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನ ಡಿನಾಟರೇಶನ್ ದ್ವಿತೀಯ ರಚನೆಗಳನ್ನು ತೆರೆಯಲು ಸಹಾಯ ಮಾಡುತ್ತದೆ, ಇದು ಮೊದಲ ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ cDNA ಯ ಇಳುವರಿಯನ್ನು ಸುಧಾರಿಸುತ್ತದೆ.)
| ಘಟಕಗಳು | ಸಂಪುಟ (μL) |
| RNase ಉಚಿತ ddH2O | 13 ಕ್ಕೆ |
| ಒಲಿಗೊ(ಡಿಟಿ)18 (50 μmol/L) ಅಥವಾ ರಾಂಡಮ್ ಪ್ರೈಮರ್ (50 μmol/L) ಅಥವಾ ಜೀನ್ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು (2 μmol/L) | 1 |
| ಅಥವಾ 1 | |
| ಅಥವಾ 1 | |
| ಆರ್ಎನ್ಎ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ | X a |
ಟಿಪ್ಪಣಿಗಳು:
1) a: ಒಟ್ಟು RNA: 1-5 ug ಅಥವಾ mRNA: 1-500 ng
2) 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 65 ° C ನಲ್ಲಿ ಕಾವುಕೊಡುವುದು, ನಂತರ 2 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ತಣ್ಣಗಾಗಲು ತಕ್ಷಣವೇ ಐಸ್ ಮೇಲೆ ವರ್ಗಾಯಿಸುವುದು.ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ದ್ರವವನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಲು ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ, ಕೆಳಗಿನ ಕೋಷ್ಟಕದಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಿರುವಂತೆ ಹಿಮ್ಮುಖ ಪ್ರತಿಲೇಖನ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಪರಿಹಾರವನ್ನು ಸೇರಿಸಿ.ಮಿಶ್ರಣ ಮಾಡಲು ನಿಧಾನವಾಗಿ ಪೈಪೆಟ್.
1.ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಮಿಶ್ರಣದ ತಯಾರಿಕೆ (20 μL ಪರಿಮಾಣ)
| ಘಟಕಗಳು | ಸಂಪುಟ (μL) |
| ಹಿಂದಿನ ಹಂತದ ಮಿಶ್ರಣ | 13 |
| 5 × ಬಫರ್ | 4 |
| dNTP ಮಿಕ್ಸ್ (10nmol/L) | 1 |
| ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ (200 U/μL) | 1 |
| RNase ಪ್ರತಿರೋಧಕ (40 U/μL) | 1 |
1.ಕೆಳಗಿನ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಿ:
| ತಾಪಮಾನ (°C) | ಸಮಯ |
| 25 °Ca | 5 ನಿಮಿಷಗಳು |
| 42 °Cb | 15-30 ನಿಮಿಷಗಳು |
| 85 °Cc | 5 ನಿಮಿಷಗಳು |
ಟಿಪ್ಪಣಿಗಳು:
1) ಎ.ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಹೆಕ್ಸಾಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಲು 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 25 ° C ನಲ್ಲಿ ಕಾವುಕೊಡುವ ಅಗತ್ಯವಿದೆ.Oligo (dT) ಬಳಸುವಾಗ ದಯವಿಟ್ಟು ಈ ಹಂತವನ್ನು ಬಿಟ್ಟುಬಿಡಿ18ಅಥವಾ ಜೀನ್ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರೈಮರ್.
2) ಬಿ.ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾದ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಶನ್ ತಾಪಮಾನವು 42 ° C ಆಗಿದೆ, ಸಂಕೀರ್ಣವಾದ ದ್ವಿತೀಯಕ ರಚನೆಗಳು ಅಥವಾ ಹೆಚ್ಚಿನ GC ವಿಷಯದೊಂದಿಗೆ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಿಗೆ, ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ತಾಪಮಾನವನ್ನು 50-55 ° C ಗೆ ಹೆಚ್ಚಿಸಲು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.
3) ಸಿ.ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಅನ್ನು ನಿಷ್ಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಲು 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 85 ° C ನಲ್ಲಿ ಬಿಸಿ ಮಾಡುವುದು.
4) ಉತ್ಪನ್ನವನ್ನು ನೇರವಾಗಿ PCR ಅಥವಾ qPCR ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳಲ್ಲಿ ಬಳಸಬಹುದು ಅಥವಾ ಅಲ್ಪಾವಧಿಯ ಶೇಖರಣೆಗಾಗಿ -20 ° C ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಬಹುದು.ದೀರ್ಘಾವಧಿಯ ಶೇಖರಣೆಗಾಗಿ ಉತ್ಪನ್ನಗಳನ್ನು ಅಲಿಗುಟ್ ಮಾಡಲು ಮತ್ತು -80 ° C ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ಆಗಾಗ್ಗೆ ಫ್ರೀಜ್-ಲೇಪವನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಿ.
5) ಉತ್ಪನ್ನವು ಒಂದು-ಹಂತದ RT-qPCR ಗೆ ಸೂಕ್ತವಾಗಿದೆ, ಪ್ರತಿ 25μL ರಿಯಾಕ್ಷನ್ ಸಿಸ್ಟಮ್‌ಗೆ 10-20 U ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಲು ಸೂಚಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಅಥವಾ ವಾಸ್ತವ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ ಕ್ರಮೇಣ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಿ.
ಟಿಪ್ಪಣಿಗಳು
1.ದಯವಿಟ್ಟು ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ಸ್ವಚ್ಛವಾಗಿಡಿ;ಕಾರ್ಯಾಚರಣೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಕ್ಲೀನ್ ಕೈಗವಸುಗಳು ಮತ್ತು ಮುಖವಾಡಗಳನ್ನು ಧರಿಸಬೇಕು.ಪ್ರಯೋಗದಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾದ ಎಲ್ಲಾ ಉಪಭೋಗ್ಯಗಳು RNase ಮಾಲಿನ್ಯವನ್ನು ತಡೆಗಟ್ಟಲು RNase ಮುಕ್ತವಾಗಿರಬೇಕು.
2.ಆರ್ಎನ್ಎ ಅವನತಿಯನ್ನು ತಡೆಗಟ್ಟಲು ಎಲ್ಲಾ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಐಸ್ನಲ್ಲಿ ನಡೆಸಬೇಕು.
3.ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್‌ನ ಹೆಚ್ಚಿನ ದಕ್ಷತೆಯನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ಉತ್ತಮ ಗುಣಮಟ್ಟದ ಆರ್ಎನ್ಎ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.
4.ಈ ಉತ್ಪನ್ನವು ಸಂಶೋಧನಾ ಬಳಕೆಗೆ ಮಾತ್ರ.
5.ನಿಮ್ಮ ಸುರಕ್ಷತೆಗಾಗಿ ದಯವಿಟ್ಟು ಲ್ಯಾಬ್ ಕೋಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಬಿಸಾಡಬಹುದಾದ ಕೈಗವಸುಗಳೊಂದಿಗೆ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸಿ.
