mRNA Cap2'-O-Methyltransferase

mRNA ಕ್ಯಾಪ್ 2´ -O-ಮೀಥೈಲ್‌ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಫರೇಸ್ ಅನ್ನು ಮರುಸಂಯೋಜಕ E. ಕೊಲಿ ಸ್ಟ್ರೈನ್‌ನಿಂದ ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ, ಇದು ಲಸಿಕೆ mRNA ಕ್ಯಾಪ್ 2 ´-O-Methyltransferase ಗಾಗಿ ಜೀನ್ ಅನ್ನು ಒಯ್ಯುತ್ತದೆ.ಈ ಕಿಣ್ವವು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯ 5'ಅಂತ್ಯದಲ್ಲಿರುವ ಕ್ಯಾಪ್ ರಚನೆಯ ಪಕ್ಕದಲ್ಲಿರುವ ಮೊದಲ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್‌ನ 2´-O ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ ಮೀಥೈಲ್ ಗುಂಪನ್ನು ಸೇರಿಸುತ್ತದೆ. ಕಿಣ್ವವು S-ಅಡೆನೊಸಿಲ್ಮೆಥಿಯೋನಿನ್ (SAM) ಅನ್ನು ಮೀಥೈಲ್ ಕ್ಯಾಪ್ಡ್ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ (ಕ್ಯಾಪ್) ಗೆ ಮೀಥೈಲ್ ದಾನಿಯಾಗಿ ಬಳಸಿಕೊಳ್ಳುತ್ತದೆ. -0) ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಕ್ಯಾಪ್- 1 ರಚನೆ.

Cap1 ರಚನೆಯು ಅನುವಾದ ದಕ್ಷತೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಬಹುದು, ವರ್ಗಾವಣೆ ಮತ್ತು ಸೂಕ್ಷ್ಮ ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ ಪ್ರಯೋಗಗಳಲ್ಲಿ mRNA ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಸುಧಾರಿಸುತ್ತದೆ. ಈ ಕಿಣ್ವಕ್ಕೆ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ m7GpppN ಕ್ಯಾಪ್ನೊಂದಿಗೆ ತಲಾಧಾರವಾಗಿ RNA ಅಗತ್ಯವಿರುತ್ತದೆ.ಇದು 5´ ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ pN, ppN, pppN ಅಥವಾ GpppN ನೊಂದಿಗೆ RNA ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುವುದಿಲ್ಲ.ಕ್ಯಾಪ್ಡ್ ಆರ್ಎನ್ಎ ಅನ್ನು ಕ್ಯಾಪ್ ಅನಲಾಗ್ ಬಳಸಿ ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ಮೂಲಕ ಅಥವಾ ವ್ಯಾಕ್ಸಿನಿಯಾ ಕ್ಯಾಪಿಂಗ್ ಕಿಣ್ವವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಎಂಜೈಮ್ಯಾಟಿಕ್ ಕ್ಯಾಪಿಂಗ್ ಮೂಲಕ ತಯಾರಿಸಬಹುದು.

ಘಟಕಗಳು

mRNA ಕ್ಯಾಪ್ 2´-O-Methyltransferase (50U/μL)

10×ಕ್ಯಾಪಿಂಗ್ ರಿಯಾಕ್ಷನ್ ಬಫರ್

ಸಂಗ್ರಹಣೆ

ಶೇಖರಣೆಗಾಗಿ -25 ～- 15℃ (ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಫ್ರೀಜ್-ಲೇಪ ಚಕ್ರಗಳನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಿ)

ಶೇಖರಣಾ ಬಫರ್

20 mM Tris-HCl（pH 8.0，25℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0. 1 mM EDTA, 0. 1% ಟ್ರೈಟಾನ್ X- 100， 50% ಗ್ಲಿಸರಾಲ್.

ಘಟಕದ ವ್ಯಾಖ್ಯಾನ

ಒಂದು ಘಟಕವನ್ನು 37 ° C ನಲ್ಲಿ 1 ಗಂಟೆಯಲ್ಲಿ 80 nt ಕ್ಯಾಪ್ಡ್ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಪ್ರತಿಲೇಖನದ 10 ಪಿಮೋಲ್‌ಗಳನ್ನು ಮಿಥೈಲೇಟ್ ಮಾಡಲು ಅಗತ್ಯವಿರುವ ಕಿಣ್ವದ ಪ್ರಮಾಣ ಎಂದು ವ್ಯಾಖ್ಯಾನಿಸಲಾಗಿದೆ.

ಗುಣಮಟ್ಟ ನಿಯಂತ್ರಣ ಪರೀಕ್ಷೆಗಳು

ಎಕ್ಸೋನ್ಯೂಕ್ಲೀಸ್:50U ಆಫ್ mRNA ಕ್ಯಾಪ್ 2 ´ -O-Methyltransferase ಜೊತೆಗೆ 1μg λ-ಹಿಂದ್ III ಡೈಜೆಸ್ಟ್ ಡಿಎನ್‌ಎ 37 ℃ 16 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಅಗರೋಸ್ ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್ ನಿರ್ಧರಿಸಿದಂತೆ ಯಾವುದೇ ಅವನತಿಯನ್ನು ನೀಡುತ್ತದೆ.

ಎಂಡೋನ್ಯೂಕ್ಲೀಸ್: 50 U ಆಫ್ mRNA ಕ್ಯಾಪ್ 2 ´ -O-Methyltransferase ಜೊತೆಗೆ 1 μg λDNA 37℃ 16 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಅಗರೋಸ್ ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್ ನಿರ್ಧರಿಸಿದಂತೆ ಯಾವುದೇ ಅವನತಿಯನ್ನು ನೀಡುತ್ತದೆ.

ನಿಕೇಸ್: 50U ಆಫ್ mRNA ಕ್ಯಾಪ್ 2 ´ -O-Methyltransferase ಜೊತೆಗೆ 1μg pBR322 37 ℃ 16 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಅಗರೋಸ್ ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್ ನಿರ್ಧರಿಸಿದಂತೆ ಯಾವುದೇ ಅವನತಿಯನ್ನು ನೀಡುತ್ತದೆ.

RNase: 50U ಆಫ್ mRNA ಕ್ಯಾಪ್ 2 ´ -O-Methyltransferase ಜೊತೆಗೆ 1.6μg MS2 RNA 37℃ ನಲ್ಲಿ 4 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಅಗರೋಸ್ ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್ ನಿರ್ಧರಿಸಿದಂತೆ ಯಾವುದೇ ಅವನತಿಯನ್ನು ನೀಡುವುದಿಲ್ಲ.

E. ಕೋಲಿ ಡಿಎನ್ಎ: 50U ಆಫ್ mRNA ಕ್ಯಾಪ್ 2´ -O-Methyltransferase ಇರುವಿಕೆಯನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾಗಿದೆE. ಕೋಲಿ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ TaqMan qPCR ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಜೀನೋಮಿಕ್ DNAE. ಕೋಲಿ 16S rRNA ಲೋಕಸ್.ದಿE. ಕೋಲಿ ಜೀನೋಮಿಕ್ ಡಿಎನ್ಎ ಮಾಲಿನ್ಯ =1E. ಕೋಲಿ ಜೀನೋಮ್.

ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾ ಎಂಡೋಟಾಕ್ಸಿನ್: LAL-ಪರೀಕ್ಷೆ, ಚೈನೀಸ್ ಫಾರ್ಮಾಕೊಪಿಯಾ IV 2020 ಆವೃತ್ತಿಯ ಪ್ರಕಾರ, ಜೆಲ್ ಮಿತಿ ಪರೀಕ್ಷಾ ವಿಧಾನ, ಸಾಮಾನ್ಯ ನಿಯಮ (1143).ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ಎಂಡೋಟಾಕ್ಸಿನ್ ಅಂಶ =10 EU/mg ಆಗಿರಬೇಕು.

ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ವ್ಯವಸ್ಥೆ ಮತ್ತು ಷರತ್ತುಗಳು

1. 1.5 mL ಮೈಕ್ರೋಫ್ಯೂಜ್ ಟ್ಯೂಬ್‌ನಲ್ಲಿ ಸೂಕ್ತ ಪ್ರಮಾಣದ ಕ್ಯಾಪ್ಡ್ RNA ಮತ್ತು RNase-ಮುಕ್ತ H2O ಅನ್ನು 16.0 µL ಅಂತಿಮ ಪರಿಮಾಣಕ್ಕೆ ಸಂಯೋಜಿಸಿ.

2. 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 65℃ ನಲ್ಲಿ ಬಿಸಿ ಮಾಡಿ ನಂತರ 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಐಸ್-ಬಾತ್ ಮಾಡಿ.

3. ನಿರ್ದಿಷ್ಟಪಡಿಸಿದ ಕ್ರಮದಲ್ಲಿ ಈ ಕೆಳಗಿನ ಘಟಕಗಳನ್ನು ಸೇರಿಸಿ (ಕ್ಯಾಪ್ಡ್ ಆರ್ಎನ್ಎಯ ಮೆತಿಲೀಕರಣಕ್ಕಾಗಿ

10 ಕ್ಕಿಂತ ಕಡಿಮೆ

*10× ಕ್ಯಾಪಿಂಗ್ ರಿಯಾಕ್ಷನ್ ಬಫರ್ : 500 mM Tris-HCl(pH 8.0, 25℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 、 10 mM DTT.

4. 1 ಗಂಟೆಗೆ 37℃ ನಲ್ಲಿ ಕಾವುಕೊಡಿ (200 nt ಗಿಂತ ಕಡಿಮೆ ಗುರಿಯ ಭಾಗಕ್ಕೆ 2 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾವು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ).

ಅರ್ಜಿಗಳನ್ನು

ಮೈಕ್ರೊಇಂಜೆಕ್ಷನ್ ಮತ್ತು ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಫೆಕ್ಷನ್ ಪ್ರಯೋಗಗಳ ಸಮಯದಲ್ಲಿ mRNA ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಸುಧಾರಿಸಲು.

ಬಳಕೆಯ ಟಿಪ್ಪಣಿಗಳು

1. ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಮೊದಲು, ಆರ್ಎನ್ಎಯನ್ನು ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಬೇಕು ಮತ್ತು ನ್ಯೂಕ್ಲೀಸ್-ಮುಕ್ತ ನೀರಿನಲ್ಲಿ ಕರಗಿಸಬೇಕು, ಎಲ್ಲಾ ಪರಿಹಾರಗಳು ಯಾವುದೇ EDTA ಮತ್ತು ಅಯಾನುಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರಬಾರದು.

2. ಪ್ರತಿಲೇಖನದ 5´ಅಂತ್ಯದಲ್ಲಿರುವ ದ್ವಿತೀಯ ರಚನೆಯನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಮೊದಲು 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಮಾದರಿ RNA ಅನ್ನು 65℃ ನಲ್ಲಿ ಬಿಸಿಮಾಡಲು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ಸಂಕೀರ್ಣ 5´-ಟರ್ಮಿನಲ್ ರಚನೆಗಾಗಿ ಇದನ್ನು 10 ನಿಮಿಷಗಳವರೆಗೆ ವಿಸ್ತರಿಸಬಹುದು.