PNGase F
ಪೆಪ್ಟೈಡ್-ಎನ್-ಗ್ಲೈಕೋಸಿಡೇಸ್ ಎಫ್ (ಪಿಎನ್‌ಜಿಸೇಸ್ ಎಫ್) ಗ್ಲೈಕೊಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳಿಂದ ಬಹುತೇಕ ಎಲ್ಲಾ ಎನ್-ಲಿಂಕ್ಡ್ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲು ಅತ್ಯಂತ ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ ಎಂಜೈಮ್ಯಾಟಿಕ್ ವಿಧಾನವಾಗಿದೆ.PNGase F ಎಂಬುದು ಅಮೈಡೇಸ್ ಆಗಿದೆ, ಇದು ಹೆಚ್ಚಿನ ಮನ್ನೋಸ್, ಹೈಬ್ರಿಡ್ ಮತ್ತು ಎನ್-ಲಿಂಕ್ಡ್ ಗ್ಲೈಕೊಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳಿಂದ ಸಂಕೀರ್ಣವಾದ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳ ಒಳಗಿನ GlcNAc ಮತ್ತು ಆಸ್ಪ್ಯಾರಜಿನ್ ಅವಶೇಷಗಳ ನಡುವೆ ಸೀಳುತ್ತದೆ.
ಅಪ್ಲಿಕೇಶನ್
ಈ ಕಿಣ್ವವು ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳಿಂದ ಕಾರ್ಬೋಹೈಡ್ರೇಟ್ ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲು ಉಪಯುಕ್ತವಾಗಿದೆ.
ತಯಾರಿ ಮತ್ತು ವಿವರಣೆ
| ಗೋಚರತೆ | ಬಣ್ಣರಹಿತ ದ್ರವ |
| ಪ್ರೋಟೀನ್ ಶುದ್ಧತೆ | ≥95% (SDS-PAGE ನಿಂದ) |
| ಚಟುವಟಿಕೆ | ≥500,000 U/mL |
| ಎಕ್ಸೋಗ್ಲೈಕೋಸಿಡೇಸ್ | ಯಾವುದೇ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲಾಗಲಿಲ್ಲ (ND) |
| ಎಂಡೋಗ್ಲೈಕೋಸಿಡೇಸ್ F1 | ND |
| ಎಂಡೋಗ್ಲೈಕೋಸಿಡೇಸ್ F2 | ND |
| ಎಂಡೋಗ್ಲೈಕೋಸಿಡೇಸ್ ಎಫ್3 | ND |
| ಎಂಡೋಗ್ಲೈಕೋಸಿಡೇಸ್ ಎಚ್ | ND |
| ಪ್ರೋಟಿಯೇಸ್ | ND |
ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳು
| EC ಸಂಖ್ಯೆ | 3.5.1.52(ಸೂಕ್ಷ್ಮಜೀವಿಗಳಿಂದ ಮರುಸಂಯೋಜಕ) |
| ಆಣ್ವಿಕ ತೂಕ | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| ಐಸೊಎಲೆಕ್ಟ್ರಿಕ್ ಪಾಯಿಂಟ್ | 8. 14 |
| ಆಪ್ಟಿಮಮ್ pH | 7.0-8.0 |
| ಅತ್ಯುತ್ತಮ ತಾಪಮಾನ | 65 °C |
| ತಲಾಧಾರದ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆ | GlcNAc ಮತ್ತು ಆಸ್ಪ್ಯಾರಜಿನ್ ಅವಶೇಷಗಳ ನಡುವಿನ ಗ್ಲೈಕೋಸಿಡಿಕ್ ಬಂಧಗಳನ್ನು ವಿಭಜಿಸುವುದು Fig.1 |
| ಗುರುತಿಸುವಿಕೆ ತಾಣಗಳು | α1-3 ಫ್ಯೂಕೋಸ್ ಫಿಗ್. 2 ಅನ್ನು ಹೊಂದಿರದ ಹೊರತು ಎನ್-ಲಿಂಕ್ಡ್ ಗ್ಲೈಕಾನ್‌ಗಳು |
| ಆಕ್ಟಿವೇಟರ್‌ಗಳು | DTT |
| ಪ್ರತಿಬಂಧಕ | SDS |
| ಶೇಖರಣಾ ತಾಪಮಾನ | -25 ~-15 ℃ |
| ಶಾಖ ನಿಷ್ಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆ | 1µL PNGase F ಅನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ 20µL ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು 75 °C ನಲ್ಲಿ 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡುವ ಮೂಲಕ ನಿಷ್ಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. |
ಚಿತ್ರ 1 PNGase F ನ ತಲಾಧಾರದ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆ
ಚಿತ್ರ 2 ಗುರುತಿಸುವಿಕೆ PNGase F.
ಆಂತರಿಕ GlcNAc ಉಳಿಕೆಗಳನ್ನು α1-3 ಫ್ಯೂಕೋಸ್‌ಗೆ ಜೋಡಿಸಿದಾಗ, PNGase F ಗ್ಲೈಕೊಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳಿಂದ N- ಲಿಂಕ್ಡ್ ಆಲಿಗೋಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಸೀಳಲು ಸಾಧ್ಯವಿಲ್ಲ.ಈ ಮಾರ್ಪಾಡು ಸಸ್ಯಗಳು ಮತ್ತು ಕೆಲವು ಕೀಟ ಗ್ಲೈಕೊಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿದೆ.
Cವಿರೋಧಿಗಳು
|
| ಘಟಕಗಳು | ಏಕಾಗ್ರತೆ |
| 1 | PNGase F | 50 μl |
| 2 | 10×ಗ್ಲೈಕೊಪ್ರೋಟೀನ್ ಡಿನಾಚರಿಂಗ್ ಬಫರ್ | 1000 μl |
| 3 | 10×ಗ್ಲೈಕೋಬಫರ್ 2 | 1000 μl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 μl |
ಘಟಕದ ವ್ಯಾಖ್ಯಾನ
10 µL ನ ಒಟ್ಟು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಪರಿಮಾಣದಲ್ಲಿ 37 ° C ನಲ್ಲಿ 1 ಗಂಟೆಯಲ್ಲಿ 10 µg ಡಿನೇಚರ್ಡ್ RNase B ನಿಂದ ಕಾರ್ಬೋಹೈಡ್ರೇಟ್‌ನ 95% ಅನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲು ಅಗತ್ಯವಿರುವ ಕಿಣ್ವದ ಮೊತ್ತವನ್ನು ಒಂದು ಘಟಕ(U) ಎಂದು ವ್ಯಾಖ್ಯಾನಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳು
1.1-20 µg ಗ್ಲೈಕೋಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು ಡಿಯೋನೈಸ್ಡ್ ನೀರಿನಿಂದ ಕರಗಿಸಿ, 10 µl ಒಟ್ಟು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಪರಿಮಾಣವನ್ನು ಮಾಡಲು 1 µl 10×ಗ್ಲೈಕೊಪ್ರೋಟೀನ್ ಡಿನಾಚರಿಂಗ್ ಬಫರ್ ಮತ್ತು H2O (ಅಗತ್ಯವಿದ್ದರೆ) ಸೇರಿಸಿ.
2.10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 100 ° C ನಲ್ಲಿ ಕಾವುಕೊಡಿ, ಅದನ್ನು ಐಸ್ನಲ್ಲಿ ತಣ್ಣಗಾಗಿಸಿ.
3.2 µl 10×GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 ಸೇರಿಸಿ ಮತ್ತು ಮಿಶ್ರಣ ಮಾಡಿ.
4.1-2 µl PNGase F ಮತ್ತು H ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಿ2O (ಅಗತ್ಯವಿದ್ದರೆ) 20 µl ಒಟ್ಟು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಪರಿಮಾಣವನ್ನು ಮಾಡಲು ಮತ್ತು ಮಿಶ್ರಣ ಮಾಡಿ.
5.60 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 37 ° C ನಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಕಾವುಕೊಡಿ.
6.SDS-PAGE ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ ಅಥವಾ HPLC ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ.
