ವ್ಯಾಕ್ಸಿನಿಯಾ ವೈರಸ್ ಕ್ಯಾಪಿಂಗ್ ಕಿಣ್ವ

ವ್ಯಾಕ್ಸಿನಿಯಾ ವೈರಸ್ ಕ್ಯಾಪಿಂಗ್ ಕಿಣ್ವವನ್ನು ಮರುಸಂಯೋಜಕ E. ಕೊಲಿ ಸ್ಟ್ರೈನ್ ವ್ಯಾಕ್ಸಿನಿಯಾ ಕ್ಯಾಪಿಂಗ್ ಕಿಣ್ವಕ್ಕೆ ಜೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಒಯ್ಯುತ್ತದೆ.ಈ ಏಕೈಕ ಕಿಣ್ವವು ಎರಡು ಉಪಘಟಕಗಳಿಂದ (D1 ಮತ್ತು D12) ಸಂಯೋಜಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ ಮತ್ತು ಮೂರು ಕಿಣ್ವಕ ಚಟುವಟಿಕೆಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ (ಆರ್ಎನ್ಎ ಟ್ರೈಫಾಸ್ಫೇಟೇಸ್ ಮತ್ತು ಗ್ವಾನಿಲೈಲ್ಟ್ರಾನ್ಸ್ಫರೇಸ್ D1 ಉಪಘಟಕದಿಂದ ಮತ್ತು ಗ್ವಾನಿನ್ ಮೀಥೈಲ್ಟ್ರಾನ್ಸ್ಫರೇಸ್ D12 ಉಪಘಟಕದಿಂದ).ವ್ಯಾಕ್ಸಿನಿಯಾ ವೈರಸ್ ಕ್ಯಾಪಿಂಗ್ ಕಿಣ್ವವು ಕ್ಯಾಪ್ ರಚನೆಯ ರಚನೆಯನ್ನು ವೇಗವರ್ಧಿಸಲು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿದೆ, ಇದು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ 7-ಮೀಥೈಲ್ಗ್ವಾನಿಲೇಟ್ ಕ್ಯಾಪ್ ರಚನೆಯನ್ನು (m7Gppp, ಕ್ಯಾಪ್ 0) RNA ಯ 5′ ಅಂತ್ಯಕ್ಕೆ ಲಗತ್ತಿಸಬಹುದು.ಕ್ಯಾಪ್ ರಚನೆ (ಕ್ಯಾಪ್ 0) ಯುಕ್ಯಾರಿಯೋಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ mRNA ಸ್ಥಿರೀಕರಣ, ಸಾರಿಗೆ ಮತ್ತು ಅನುವಾದದಲ್ಲಿ ಪ್ರಮುಖ ಪಾತ್ರವನ್ನು ವಹಿಸುತ್ತದೆ.ಎಂಜೈಮ್ಯಾಟಿಕ್ ಕ್ರಿಯೆಯ ಮೂಲಕ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಕ್ಯಾಪಿಂಗ್ ಮಾಡುವುದು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ ಮತ್ತು ಸರಳ ವಿಧಾನವಾಗಿದ್ದು, ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್, ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಫೆಕ್ಷನ್ ಮತ್ತು ಮೈಕ್ರೊಇನ್ಜೆಕ್ಷನ್‌ಗಾಗಿ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯ ಸ್ಥಿರತೆ ಮತ್ತು ಅನುವಾದವನ್ನು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಸುಧಾರಿಸಬಹುದು.

ಘಟಕಗಳು

ವ್ಯಾಕ್ಸಿನಿಯಾ ವೈರಸ್ ಕ್ಯಾಪಿಂಗ್ ಕಿಣ್ವ (10 U/μL)

10×ಕ್ಯಾಪಿಂಗ್ ಬಫರ್

ಶೇಖರಣಾ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳು

ಶೇಖರಣೆಗಾಗಿ -25～- 15℃ (ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಫ್ರೀಜ್-ಲೇಪ ಚಕ್ರಗಳನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಿ)

ಶೇಖರಣಾ ಬಫರ್

20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl,

1mM DTT, 0. 1mM EDTA, 0. 1% ಟ್ರೈಟಾನ್ X- 100, 50% ಗ್ಲಿಸರಾಲ್.

ಘಟಕದ ವ್ಯಾಖ್ಯಾನ

ವ್ಯಾಕ್ಸಿನಿಯಾ ವೈರಸ್ ಕ್ಯಾಪಿಂಗ್ ಕಿಣ್ವದ ಒಂದು ಘಟಕವು 10pmol GTP ಯನ್ನು 37 ° C ನಲ್ಲಿ 1 ಗಂಟೆಯಲ್ಲಿ 80nt ಪ್ರತಿಲೇಖನಕ್ಕೆ ಸಂಯೋಜಿಸಲು ಅಗತ್ಯವಿರುವ ಕಿಣ್ವದ ಪ್ರಮಾಣ ಎಂದು ವ್ಯಾಖ್ಯಾನಿಸಲಾಗಿದೆ.

ಗುಣಮಟ್ಟ ನಿಯಂತ್ರಣ

ಎಕ್ಸೋನ್ಯೂಕ್ಲೀಸ್:16 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ 37 ℃ ನಲ್ಲಿ 1μg λ-ಹಿಂದ್ III ಡೈಜೆಸ್ಟ್ ಡಿಎನ್‌ಎಯೊಂದಿಗೆ ವ್ಯಾಕ್ಸಿನಿಯಾ ವೈರಸ್ ಕ್ಯಾಪಿಂಗ್ ಕಿಣ್ವದ 10U ಅಗರೋಸ್ ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್ ನಿರ್ಧರಿಸಿದಂತೆ ಯಾವುದೇ ಅವನತಿಯನ್ನು ನೀಡುವುದಿಲ್ಲ.

ಎಂಡೋನ್ಯೂಕ್ಲೀಸ್:16 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ 37℃ ನಲ್ಲಿ 1μg λDNA ಜೊತೆ ವ್ಯಾಕ್ಸಿನಿಯಾ ವೈರಸ್ ಕ್ಯಾಪಿಂಗ್ ಕಿಣ್ವದ 10U ಅಗರೋಸ್ ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್ ನಿರ್ಧರಿಸಿದಂತೆ ಯಾವುದೇ ಅವನತಿಯನ್ನು ನೀಡುವುದಿಲ್ಲ.

ನಿಕೇಸ್:16 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ 37 ℃ ನಲ್ಲಿ 1 μg pBR322 ನೊಂದಿಗೆ ವ್ಯಾಕ್ಸಿನಿಯಾ ವೈರಸ್ ಕ್ಯಾಪಿಂಗ್ ಕಿಣ್ವದ 10U ಅಗರೋಸ್ ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್ ನಿರ್ಧರಿಸಿದಂತೆ ಯಾವುದೇ ಅವನತಿಯನ್ನು ನೀಡುವುದಿಲ್ಲ.

RNase:10U ವ್ಯಾಕ್ಸಿನಿಯಾ ವೈರಸ್ ಕ್ಯಾಪಿಂಗ್ ಕಿಣ್ವವು 1.6μg MS2 RNAಯೊಂದಿಗೆ 4 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ 37℃ ನಲ್ಲಿ ಅಗರೋಸ್ ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್ ನಿರ್ಧರಿಸಿದಂತೆ ಯಾವುದೇ ಅವನತಿಯನ್ನು ನೀಡುವುದಿಲ್ಲ.

1.ಕೋಲಿ ಡಿಎನ್ಎ:E. coli 16S rRNA ಲೊಕಸ್‌ಗೆ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾದ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ TaqMan qPCR ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು E. ಕೋಲಿ ಜೀನೋಮಿಕ್ DNA ಇರುವಿಕೆಗಾಗಿ ವ್ಯಾಕ್ಸಿನಿಯಾ ವೈರಸ್ ಕ್ಯಾಪಿಂಗ್ ಕಿಣ್ವದ 10U ಅನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.E. ಕೋಲಿ ಜೀನೋಮಿಕ್ DNA ಮಾಲಿನ್ಯವು ≤1 E. ಕೋಲಿ ಜೀನೋಮ್ ಆಗಿದೆ.

2.ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾ ಎಂಡೋಟಾಕ್ಸಿನ್: LAL-ಪರೀಕ್ಷೆ, ಚೈನೀಸ್ ಫಾರ್ಮಾಕೊಪೋಯಾ IV 2020 ಆವೃತ್ತಿಯ ಪ್ರಕಾರ, ಜೆಲ್ ಮಿತಿ ಪರೀಕ್ಷಾ ವಿಧಾನ, ಸಾಮಾನ್ಯ ನಿಯಮ (1143).ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ಎಂಡೋಟಾಕ್ಸಿನ್ ಅಂಶವು ≤10 EU/mg ಆಗಿರಬೇಕು.

ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ವ್ಯವಸ್ಥೆ ಮತ್ತು ಷರತ್ತುಗಳು

1. ಕ್ಯಾಪಿಂಗ್ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್ (ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಪರಿಮಾಣ: 20 μL)

ಈ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವು 10μg ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ (≥100 ಎನ್‌ಟಿ) ಯ ಕ್ಯಾಪಿಂಗ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗೆ ಅನ್ವಯಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಬೇಡಿಕೆಗಳ ಪ್ರಕಾರ ಅದನ್ನು ಅಳೆಯಬಹುದು.

I) 10μg RNA ಮತ್ತು ನ್ಯೂಕ್ಲೀಸ್-ಮುಕ್ತ H2O ಅನ್ನು 1.5 ಮಿಲಿ ಮೈಕ್ರೋಫ್ಯೂಜ್ ಟ್ಯೂಬ್‌ನಲ್ಲಿ 15.0 µL ಅಂತಿಮ ಪರಿಮಾಣಕ್ಕೆ ಸಂಯೋಜಿಸಿ.*10×ಕ್ಯಾಪಿಂಗ್ ಬಫರ್: 0.5M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH 8.0)

2) 65℃ ನಲ್ಲಿ 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಬಿಸಿ ಮಾಡಿ ನಂತರ 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಐಸ್ ಸ್ನಾನ ಮಾಡಿ.

3) ನಿರ್ದಿಷ್ಟಪಡಿಸಿದ ಕ್ರಮದಲ್ಲಿ ಕೆಳಗಿನ ಘಟಕಗಳನ್ನು ಸೇರಿಸಿ

*10×ಕ್ಯಾಪಿಂಗ್ ಬಫರ್: 0.5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH8.0)

4) 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 37 ° C ನಲ್ಲಿ ಕಾವುಕೊಡಿ, RNA ಈಗ ಮುಚ್ಚಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ ಮತ್ತು ಡೌನ್‌ಸ್ಟ್ರೀಮ್ ಅಪ್ಲಿಕೇಶನ್‌ಗಳಿಗೆ ಸಿದ್ಧವಾಗಿದೆ.

2. 5′ ಟರ್ಮಿನಲ್ ಲೇಬಲಿಂಗ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ (ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಪರಿಮಾಣ: 20 μL)

ಈ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್ ಅನ್ನು 5´ ಟ್ರೈಫಾಸ್ಫೇಟ್ ಹೊಂದಿರುವ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಅದನ್ನು ಬೇಡಿಕೆಗಳಿಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ ಅಳೆಯಬಹುದು.ಲೇಬಲ್ ಸಂಯೋಜನೆಯ ದಕ್ಷತೆಯು RNA ಯ ಮೋಲಾರ್ ಅನುಪಾತದಿಂದ ಪ್ರಭಾವಿತವಾಗಿರುತ್ತದೆ: GTP, ಹಾಗೆಯೇ RNA ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿನ GTP ವಿಷಯ.

1) 1.5 ಮಿಲಿ ಮೈಕ್ರೋಫ್ಯೂಜ್ ಟ್ಯೂಬ್‌ನಲ್ಲಿ ಸೂಕ್ತ ಪ್ರಮಾಣದ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಮತ್ತು ನ್ಯೂಕ್ಲೀಸ್-ಮುಕ್ತ H2O ಅನ್ನು 14.0 µL ಅಂತಿಮ ಪರಿಮಾಣಕ್ಕೆ ಸಂಯೋಜಿಸಿ.

2) 65℃ ನಲ್ಲಿ 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಬಿಸಿ ಮಾಡಿ ನಂತರ 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಐಸ್ ಸ್ನಾನ ಮಾಡಿ.

3) ನಿರ್ದಿಷ್ಟಪಡಿಸಿದ ಕ್ರಮದಲ್ಲಿ ಕೆಳಗಿನ ಘಟಕಗಳನ್ನು ಸೇರಿಸಿ.

** GTP MIX GTP ಮತ್ತು ಸಣ್ಣ ಸಂಖ್ಯೆಯ ಮಾರ್ಕರ್‌ಗಳನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.GTP ಯ ಸಾಂದ್ರತೆಗಾಗಿ, ಉಲ್ಲೇಖಿಸಿಗಮನಿಸಿ 3.

4) 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 37 ° C ನಲ್ಲಿ ಕಾವುಕೊಡಿ, RNA 5′ ಅಂತ್ಯವನ್ನು ಈಗ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಡೌನ್‌ಸ್ಟ್ರೀಮ್‌ಗೆ ಸಿದ್ಧವಾಗಿದೆ

ಅರ್ಜಿಗಳನ್ನು

1. ಭಾಷಾಂತರ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಳು/ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ ಅನುವಾದದ ಮೊದಲು mRNA ಅನ್ನು ಮುಚ್ಚುವುದು

2. mRNAಯ 5´ ಅಂತ್ಯವನ್ನು ಲೇಬಲ್ ಮಾಡುವುದು

ಬಳಕೆಯ ಟಿಪ್ಪಣಿಗಳು

1.ವ್ಯಾಕ್ಸಿನಿಯಾ ಕ್ಯಾಪಿಂಗ್ ಕಿಣ್ವದೊಂದಿಗೆ ಕಾವುಕೊಡುವ ಮೊದಲು ಆರ್ಎನ್ಎ ದ್ರಾವಣವನ್ನು ಬಿಸಿ ಮಾಡುವುದರಿಂದ ಪ್ರತಿಲೇಖನದ 5'ಅಂತ್ಯದಲ್ಲಿ ದ್ವಿತೀಯಕ ರಚನೆಯನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕುತ್ತದೆ.ತಿಳಿದಿರುವ ಹೆಚ್ಚು ರಚನಾತ್ಮಕ 5'ಅಂತ್ಯಗಳೊಂದಿಗೆ ಪ್ರತಿಲೇಖನಗಳಿಗಾಗಿ ಸಮಯವನ್ನು 60 ನಿಮಿಷಗಳವರೆಗೆ ವಿಸ್ತರಿಸಿ.

2. ಕ್ಯಾಪಿಂಗ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳಿಗೆ ಬಳಸಲಾಗುವ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಬಳಕೆಗೆ ಮೊದಲು ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಬೇಕು ಮತ್ತು ನ್ಯೂಕ್ಲೀಸ್-ಮುಕ್ತ ನೀರಿನಲ್ಲಿ ಅಮಾನತುಗೊಳಿಸಬೇಕು.EDTA ಇರಬಾರದು ಮತ್ತು ದ್ರಾವಣವು ಲವಣಗಳಿಂದ ಮುಕ್ತವಾಗಿರಬೇಕು.

3. 5´ ಅಂತ್ಯವನ್ನು ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲು, ಒಟ್ಟು GTP ಸಾಂದ್ರತೆಯು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ mRNA ಯ ಮೋಲಾರ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಸುಮಾರು 1-3 ಬಾರಿ ಇರಬೇಕು.

4. ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯ ಪರಿಮಾಣವನ್ನು ವಾಸ್ತವದ ಪ್ರಕಾರ ಮೇಲಕ್ಕೆ ಅಥವಾ ಕೆಳಕ್ಕೆ ಅಳೆಯಬಹುದು.