ಎಂಡೋಫ್ರೀ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ ಮ್ಯಾಕ್ಸಿ ಕಿಟ್
ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾವನ್ನು ಲೈಸ್ ಮಾಡಲು ಸುಧಾರಿತ SDS-ಕ್ಷಾರೀಯ ಲೈಸಿಸ್ ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ ಬೆಳೆಸಿದ 150 - 300 ಮಿಲಿ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ದ್ರಾವಣದಿಂದ ಹೊರತೆಗೆಯಲು ಈ ಕಿಟ್ ಸೂಕ್ತವಾಗಿದೆ.ಕಚ್ಚಾ ಸಾರವನ್ನು ವಿಶಿಷ್ಟವಾದ ಎಂಡೋಟಾಕ್ಸಿನ್ ಸ್ಕ್ಯಾವೆಂಜರ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಆಯ್ದವಾಗಿ ಸಂಯೋಜಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಎಂಡೋಟಾಕ್ಸಿನ್‌ಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲು ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿಯಿಂದ ಬೇರ್ಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ನಂತರ, ಸಿಲಿಕಾ ಜೆಲ್ ಪೊರೆಯು ಹೆಚ್ಚಿನ ಉಪ್ಪು ಮತ್ತು ಕಡಿಮೆ-ಪಿಹೆಚ್ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ದ್ರಾವಣದಲ್ಲಿ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ ಡಿಎನ್ಎಗೆ ಆಯ್ದವಾಗಿ ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ.ಇದರ ನಂತರ ಕಲ್ಮಶಗಳು ಮತ್ತು ಇತರ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ಘಟಕಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲು ವಾಶ್ ಬಫರ್ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಅಂತಿಮವಾಗಿ, ಸಿಲಿಕಾನ್ ಮ್ಯಾಟ್ರಿಕ್ಸ್ ಮೆಂಬರೇನ್‌ನಿಂದ ಶುದ್ಧ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ ಡಿಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಹೊರಹಾಕಲು ಕಡಿಮೆ-ಉಪ್ಪು, ಹೆಚ್ಚಿನ-ಪಿಹೆಚ್ ಎಲುಷನ್ ಬಫರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಸಿಲಿಕಾ ಜೆಲ್ ಮೆಂಬರೇನ್ ವಿಶೇಷ ಹೊರಹೀರುವಿಕೆ ಮೆಂಬರೇನ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಳ್ಳುತ್ತದೆ, ಮತ್ತು ಕಾಲಮ್ ಮತ್ತು ಕಾಲಮ್ ನಡುವಿನ ಹೊರಹೀರುವಿಕೆಯ ಪ್ರಮಾಣದ ವ್ಯತ್ಯಾಸವು ತುಂಬಾ ಚಿಕ್ಕದಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಪುನರಾವರ್ತನೆಯು ಉತ್ತಮವಾಗಿದೆ.ಫೀನಾಲ್, ಕ್ಲೋರೊಫಾರ್ಮ್ ಮತ್ತು ಇತರ ವಿಷಕಾರಿ ಕಾರಕಗಳು ಅಗತ್ಯವಿಲ್ಲ, ಮತ್ತು ಎಥೆನಾಲ್ ಅವಕ್ಷೇಪನ ಹಂತಗಳೂ ಇಲ್ಲ.ಈ ಕಿಟ್ ಅನ್ನು 80% -90% ರಷ್ಟು ಹೊರತೆಗೆಯುವ ದರದೊಂದಿಗೆ 0.2 -1.5 ಮಿಗ್ರಾಂ ಶುದ್ಧ ಹೈ-ಕಾಪಿ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ ಡಿಎನ್‌ಎಯನ್ನು ತ್ವರಿತವಾಗಿ ಹೊರತೆಗೆಯಲು ಬಳಸಬಹುದು.ಕಿಟ್ ಎಂಡೋಟಾಕ್ಸಿನ್ ಅನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕುವ ವಿಶಿಷ್ಟ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆ ಸೂತ್ರವನ್ನು ಬಳಸುತ್ತದೆ, ಎಂಡೋಟಾಕ್ಸಿನ್ ಅಂಶವು ಅತ್ಯಂತ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಜೀವಕೋಶದ ವರ್ಗಾವಣೆಯ ಪರಿಣಾಮವು ಅತ್ಯುತ್ತಮವಾಗಿರುತ್ತದೆ.ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ ಅನ್ನು ಕಿಣ್ವ ಜೀರ್ಣಕ್ರಿಯೆ, ಪಿಸಿಆರ್, ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್, ರೂಪಾಂತರ, ಅನುಕ್ರಮ ಮತ್ತು ಇತರ ಆಣ್ವಿಕ ಜೀವಶಾಸ್ತ್ರ ಪ್ರಯೋಗಗಳಲ್ಲಿ ನೇರವಾಗಿ ಬಳಸಬಹುದು.
ಶೇಖರಣಾ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳು
RNaseA ಅನ್ನು -30 ~ -15℃ ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಬೇಕು ಮತ್ತು ≤0℃ ನಲ್ಲಿ ಸಾಗಿಸಬೇಕು.
ಎಂಡೋಟಾಕ್ಸಿನ್ ಸ್ಕ್ಯಾವೆಂಜರ್ ಅನ್ನು ಒಂದು ತಿಂಗಳವರೆಗೆ 2 ~ 8℃ ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಬಹುದು, ದೀರ್ಘಾವಧಿಯ ಶೇಖರಣೆಗಾಗಿ -30 ~ -15℃ ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಬಹುದುಮತ್ತು ≤0℃ ನಲ್ಲಿ ಸಾಗಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಇತರ ಘಟಕಗಳನ್ನು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ (15 ~25℃) ಸಂಗ್ರಹಿಸಬೇಕು ಮತ್ತು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ಸಾಗಿಸಬೇಕು.
ಘಟಕಗಳು
| ಘಟಕಗಳು | 10RXNS |
| ಆರ್‌ನೇಸ್ ಎ | 750 μL |
| ಬಫರ್ P1 | 75 ಮಿ.ಲೀ |
| ಬಫರ್ P2 | 75 ಮಿ.ಲೀ |
| ಬಫರ್ P4 | 75 ಮಿ.ಲೀ |
| ಎಂಡೋಟಾಕ್ಸಿನ್ ಸ್ಕ್ಯಾವೆಂಜರ್ | 25 ಮಿ.ಲೀ |
| ಬಫರ್ PW | 2 × 22 ಮಿಲಿ |
| ಬಫರ್ ಟಿಬಿ | 20 ಮಿ.ಲೀ |
| ಫಾಸ್ಟ್‌ಪ್ಯೂರ್ ಡಿಎನ್ಎ ಮ್ಯಾಕ್ಸಿ ಕಾಲಮ್ಗಳು (ಪ್ರತಿಯೊಂದೂ 50 ಮಿಲಿ ಕಲೆಕ್ಷನ್ ಟ್ಯೂಬ್‌ನಲ್ಲಿ) | 10 |
| ಎಂಡೋಟಾಕ್ಸಿನ್-ಮುಕ್ತ ಕಲೆಕ್ಷನ್ ಟ್ಯೂಬ್ | 2 × 5 |
RNaseA:10 mg/ml, RNA ಅನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಬಫರ್ P1:ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ಅಮಾನತು ಬಫರ್, ಮೊದಲ ಬಳಕೆಯ ಮೊದಲು RNaseA ಅನ್ನು ಬಫರ್ P1 ಗೆ ಸೇರಿಸಿ.
ಬಫರ್ P2:ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ಲೈಸಿಸ್ ಬಫರ್ (SDS/NaOH ಅನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುತ್ತದೆ).
ಬಫರ್ P4:ತಟಸ್ಥಗೊಳಿಸುವ ಬಫರ್.
ಎಂಡೋಟಾಕ್ಸಿನ್ ಸ್ಕ್ಯಾವೆಂಜರ್:ಕಚ್ಚಾ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ ಸಾರದಿಂದ ಎಂಡೋಟಾಕ್ಸಿನ್ ಅನ್ನು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿ ತೆಗೆದುಹಾಕುತ್ತದೆ.
ಬಫರ್ PW:ಬಫರ್ ಅನ್ನು ತೊಳೆಯಿರಿ, ಮೊದಲ ಬಳಕೆಗೆ ಮೊದಲು ಎಥೆನಾಲ್ನ ನಿಗದಿತ ಪರಿಮಾಣವನ್ನು ಸೇರಿಸಿ.
ಬಫರ್ ಟಿಬಿ:ಎಲುಷನ್ ಬಫರ್.
ಫಾಸ್ಟ್‌ಪ್ಯೂರ್ ಡಿಎನ್ಎ ಮ್ಯಾಕ್ಸಿ ಕಾಲಮ್ಗಳು:ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ ಡಿಎನ್ಎ ಹೊರಹೀರುವಿಕೆ ಕಾಲಮ್ಗಳು.
50 ಮಿಲಿ ಸಂಗ್ರಹಣಾ ಕೊಳವೆಗಳು:ಫಿಲ್ಟರ್ ಸಂಗ್ರಹ ಟ್ಯೂಬ್ಗಳು.
ಎಂಡೋಟಾಕ್ಸಿನ್-ಮುಕ್ತ ಕಲೆಕ್ಷನ್ ಟ್ಯೂಬ್:ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ ಡಿಎನ್ಎ ಸಂಗ್ರಹ ಟ್ಯೂಬ್ಗಳು.
ಸಿದ್ಧಪಡಿಸಿದ ವಸ್ತುಗಳು
ಸಂಪೂರ್ಣ ಎಥೆನಾಲ್, ಐಸೊಪ್ರೊಪನಾಲ್, 50 ಮಿಲಿ ರೌಂಡ್-ಬಾಟಮ್ ಸೆಂಟ್ರಿಫ್ಯೂಜ್ ಟ್ಯೂಬ್ಗಳು ಮತ್ತು 50 ಮಿಲಿ ಎಂಡೋಟಾಕ್ಸಿನ್-ಮುಕ್ತಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಟ್ಯೂಬ್ಗಳು.
ಅರ್ಜಿಗಳನ್ನು
ಈ ಉತ್ಪನ್ನವು 150 - 300 ಮಿಲಿ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ದ್ರಾವಣದಿಂದ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ಗಳ ದೊಡ್ಡ ಪ್ರಮಾಣದ ಹೊರತೆಗೆಯುವಿಕೆಗೆ ಸೂಕ್ತವಾಗಿದೆರಾತ್ರೋರಾತ್ರಿ ಸುಸಂಸ್ಕೃತ.
ಪ್ರಯೋಗ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆ
1. 150 - 200 ಮಿಲಿ (300 ಮಿಲಿಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿಲ್ಲ) ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ದ್ರಾವಣವನ್ನು ರಾತ್ರಿಯಲ್ಲಿ ಕಲ್ಚರ್ ಮಾಡಿ ಮತ್ತು ಸೆಂಟ್ರಿಫ್ಯೂಜ್ ಅನ್ನು ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳಿ1 - 2 ನಿಮಿಷಕ್ಕೆ ಸುಮಾರು 11,000 rpm (12,000 × g)ಸೂಪರ್ನಾಟಂಟ್ ಅನ್ನು ತಿರಸ್ಕರಿಸಿ ಮತ್ತು ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾವನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ.
Δ 50 ಮಿಲಿಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ದ್ರಾವಣವನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸುವಾಗ, ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ದ್ರಾವಣವನ್ನು ಸೇರಿಸುವ ಮೂಲಕ, ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿಗೊಳಿಸುವಿಕೆ, ಸೂಪರ್ನಾಟಂಟ್ ಅನ್ನು ತಿರಸ್ಕರಿಸುವ ಮೂಲಕ ಮತ್ತು ಅದೇ 50 ಮಿಲಿ ಟ್ಯೂಬ್‌ನಲ್ಲಿ ಇತರ ಹಂತಗಳ ಮೂಲಕ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾವನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಬಹುದು.
ಅನೇಕ ಬಾರಿ.
2. 7.5 ಮಿಲಿ ಬಫರ್ P1 (ದಯವಿಟ್ಟು RNaseA ಅನ್ನು ಬಫರ್ P1 ಗೆ ಸೇರಿಸಲಾಗಿದೆಯೇ ಎಂದು ಪರಿಶೀಲಿಸಿ) ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿಗೆ ಸೇರಿಸಿಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಟ್ಯೂಬ್ ಮತ್ತು ಸುಳಿಯ ಅಥವಾ ಪೈಪೆಟಿಂಗ್ ಮೂಲಕ ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಮಿಶ್ರಣ ಮಾಡಿ.
Δ ಈ ಹಂತದಲ್ಲಿ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ಸಂಪೂರ್ಣ ಪುನರುಜ್ಜೀವನವು ಇಳುವರಿಗೆ ನಿರ್ಣಾಯಕವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಮರುಹೊಂದಿಸಿದ ನಂತರ ಯಾವುದೇ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ಕ್ಲಂಪ್‌ಗಳು ಇರಬಾರದು.ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಮಿಶ್ರಣವಾಗದ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ಕ್ಲಂಪ್‌ಗಳು ಇದ್ದರೆ, ಅದು ಲೈಸಿಸ್ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ, ಇದು ಕಡಿಮೆ ಇಳುವರಿ ಮತ್ತು ಶುದ್ಧತೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ.ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ದ್ರಾವಣದ OD600 0.65 ಆಗಿದ್ದರೆ, 150 ಮಿಲಿ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ದ್ರಾವಣದಿಂದ ಹೊರತೆಗೆಯುವಾಗ 7.5 ಮಿಲಿ ಬಫರ್ P1 ಅನ್ನು ಬಳಸಲು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ;OD600 0.75 ಆಗಿರುವಾಗ, 8 ಮಿಲಿ ಬಫರ್ P1 ಅನ್ನು ಬಳಸಬೇಕು ಮತ್ತು ಬಫರ್ಸ್ P2 ಮತ್ತು P4 ನ ಪರಿಮಾಣಗಳನ್ನು ಅದಕ್ಕೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ ಬದಲಾಯಿಸಬೇಕು.ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ದ್ರಾವಣದ ಪರಿಮಾಣವನ್ನು 200 ಮಿಲಿಗೆ ಹೆಚ್ಚಿಸಿದರೆ, ಅದನ್ನು ಸೂಚಿಸಲಾಗುತ್ತದೆP1, P2 ಮತ್ತು P4 ಬಫರ್‌ಗಳ ಪರಿಮಾಣವನ್ನು ಪ್ರಮಾಣಾನುಗುಣವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
3. ಹಂತ 2 ರಿಂದ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ಅಮಾನತುಗೆ 7.5 ಮಿಲಿ ಬಫರ್ P2 ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಿ ಮತ್ತು 6 - 8 ವರೆಗೆ ನಿಧಾನವಾಗಿ ಮೇಲಕ್ಕೆ ಮತ್ತು ಕೆಳಕ್ಕೆ ಮಿಶ್ರಣ ಮಾಡಿಬಾರಿ ಮತ್ತು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 4 - 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಿ.
Δ ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಮಿಶ್ರಣ ಮಾಡಲು ನಿಧಾನವಾಗಿ ತಿರುಗಿಸಿ.ಸುಳಿಯುವಿಕೆಯು ಜೀನೋಮಿಕ್ ಡಿಎನ್ಎ ವಿಘಟನೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ, ಇದರ ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್‌ನಲ್ಲಿ ಜೀನೋಮಿಕ್ ಡಿಎನ್ಎ ತುಣುಕುಗಳು ಉಂಟಾಗುತ್ತವೆ.ಈ ಸಮಯದಲ್ಲಿ, ದ್ರಾವಣವು ಸ್ನಿಗ್ಧತೆ ಮತ್ತು ಅರೆಪಾರದರ್ಶಕವಾಗುತ್ತದೆ, ಇದು ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾವನ್ನು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಲೈಸ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ.ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ಗಳ ನಾಶವನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಲು ಅವಧಿಯು 5 ನಿಮಿಷಗಳನ್ನು ಮೀರಬಾರದು.ಪರಿಹಾರವು ಸ್ಪಷ್ಟವಾಗಿಲ್ಲದಿದ್ದರೆ, ಹಲವಾರು ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾಗಳು ಉಂಟಾಗಬಹುದುಅಪೂರ್ಣ ಲೈಸಿಸ್, ಆದ್ದರಿಂದ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಸೂಕ್ತವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಬೇಕು.
4. 3 ನೇ ಹಂತದಿಂದ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ಅಮಾನತುಗೆ 7.5 ಮಿಲಿ ಬಫರ್ P4 ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಿ ಮತ್ತು ಬಫರ್ P2 ಅನ್ನು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ತಟಸ್ಥಗೊಳಿಸಲು ಪರಿಹಾರವನ್ನು ಅನುಮತಿಸಲು ತಕ್ಷಣವೇ 6 - 8 ಬಾರಿ ನಿಧಾನವಾಗಿ ತಲೆಕೆಳಗು ಮಾಡಿ.ಈ ಸಮಯದಲ್ಲಿ, ಬಿಳಿ ಫ್ಲೋಕ್ಯುಲೆಂಟ್ ಅವಕ್ಷೇಪವು ಕಾಣಿಸಿಕೊಳ್ಳಬೇಕು.10 - 15 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಸುಮಾರು 11,000 rpm (12,000 × g) ಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ, ಹೊಸ 50 ಮಿಲಿ ಸುತ್ತಿನ-ಕೆಳಗಿನ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಟ್ಯೂಬ್ (ಸ್ವಯಂ-ತಯಾರಿಸಲಾಗಿದೆ) ಗೆ ಸೂಪರ್ನಾಟಂಟ್ ಅನ್ನು ಎಚ್ಚರಿಕೆಯಿಂದ ಪಿಪ್ಪೆಟ್ ಮಾಡಿ ಮತ್ತು ತಪ್ಪಿಸಿತೇಲುವ ಬಿಳಿ ಅವಕ್ಷೇಪವನ್ನು ಆಶಿಸುತ್ತವೆ.
Δ ಬಫರ್ P4 ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಿ ಮತ್ತು ಚೆನ್ನಾಗಿ ಮಿಶ್ರಣ ಮಾಡಲು ತಕ್ಷಣವೇ ತಲೆಕೆಳಗು ಮಾಡಿ.ತಟಸ್ಥೀಕರಣದ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುವ ಸ್ಥಳೀಯ ಮಳೆಯ ಉತ್ಪಾದನೆಯನ್ನು ತಡೆಗಟ್ಟಲು ಬಿಳಿ ಅವಕ್ಷೇಪವನ್ನು ದ್ರಾವಣದ ಉದ್ದಕ್ಕೂ ಸಮವಾಗಿ ವಿತರಿಸುವವರೆಗೆ ಟ್ಯೂಬ್ ನಿಲ್ಲಲು ಬಿಡಿ.ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿಗೊಳಿಸುವ ಮೊದಲು ಏಕರೂಪದ ಬಿಳಿ ಫ್ಲೋಕ್ಯುಲೆಂಟ್ ಅವಕ್ಷೇಪವಿಲ್ಲದಿದ್ದರೆ ಮತ್ತು ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ನಂತರ ಸೂಪರ್ನಾಟಂಟ್ ಸ್ಪಷ್ಟವಾಗಿಲ್ಲದಿದ್ದರೆ, ಟ್ಯೂಬ್ ಆಗಿರಬಹುದುಇನ್ನೊಂದು 5 ನಿಮಿಷಕ್ಕೆ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ.
5. ಹಂತ 4 ರಿಂದ ಸೂಪರ್‌ನಾಟಂಟ್‌ಗೆ ಎಂಡೋಟಾಕ್ಸಿನ್ ಸ್ಕ್ಯಾವೆಂಜರ್‌ನ 0. 1 ಪಟ್ಟು (ಸೂಪರ್ನಾಟಂಟ್ ಪರಿಮಾಣದ 10%, ಸುಮಾರು 2.2 ಮಿಲಿ) ಸೇರಿಸಿ ಮತ್ತು ಮಿಶ್ರಣಕ್ಕೆ ತಿರುಗಿಸಿ.ದ್ರಾವಣವನ್ನು ಐಸ್ ಸ್ನಾನದಲ್ಲಿ ಇರಿಸಿ ಅಥವಾ 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಪುಡಿಮಾಡಿದ ಐಸ್ (ಅಥವಾ ರೆಫ್ರಿಜರೇಟರ್ ಫ್ರೀಜರ್) ನಲ್ಲಿ ದ್ರಾವಣವು ಟರ್ಬೈಡ್ನಿಂದ ಸ್ಪಷ್ಟ ಮತ್ತು ಪಾರದರ್ಶಕವಾಗಿ ಬದಲಾಗುವವರೆಗೆ (ಅಥವಾ ಇನ್ನೂಸ್ವಲ್ಪ ಪ್ರಕ್ಷುಬ್ಧ), ಮತ್ತು ಸಾಂದರ್ಭಿಕವಾಗಿ ಹಲವಾರು ಬಾರಿ ಮಿಶ್ರಣ ಮಾಡಿ.
Δ ಎಂಡೋಟಾಕ್ಸಿನ್ ಸ್ಕ್ಯಾವೆಂಜರ್ ಅನ್ನು ಸೂಪರ್‌ನಾಟಂಟ್‌ಗೆ ಸೇರಿಸಿದ ನಂತರ, ಸೂಪರ್ನಾಟಂಟ್ ಟರ್ಬಿಡ್ ಆಗುತ್ತದೆ ಆದರೆಐಸ್ ಸ್ನಾನದಲ್ಲಿ ತಂಪಾಗಿಸಿದ ನಂತರ ಸೂಪರ್ನಾಟಂಟ್ ಸ್ಪಷ್ಟವಾಗಿರಬೇಕು (ಅಥವಾ ಸ್ವಲ್ಪ ಪ್ರಕ್ಷುಬ್ಧವಾಗಿರಬೇಕು).
6. 10 - 15 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ (>25℃) ಸೂಪರ್ನಾಟಂಟ್ ಅನ್ನು ಇರಿಸಿದ ನಂತರ, ಅದು ಟರ್ಬಿಡ್ ಆಗುತ್ತದೆಅದರ ಉಷ್ಣತೆಯು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶಕ್ಕೆ ಹೆಚ್ಚಾಗುತ್ತದೆ.ನಂತರ ಸೂಪರ್ನಾಟಂಟ್ ಅನ್ನು ಮಿಶ್ರಣ ಮಾಡಲು ತಲೆಕೆಳಗಾದ ಮಾಡಬೇಕು.
Δ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣತೆಯು ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದ್ದರೆ ಅಥವಾ ನೀವು ಹೊರತೆಗೆಯುವ ಸಮಯವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು ಬಯಸಿದರೆ, ಸೂಪರ್ನಾಟಂಟ್ ಅನ್ನು 37 ~ 42 ℃ ನೀರಿನ ಸ್ನಾನದಲ್ಲಿ 5 - 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವು ಮಾಡಬಹುದು ಮತ್ತು ಮುಂದಿನ ಹಂತವನ್ನು ಸೂಪರ್ನಾಟಂಟ್ ನಂತರ ಕೈಗೊಳ್ಳಬಹುದು.ಪ್ರಕ್ಷುಬ್ಧವಾಗುತ್ತದೆ.
7. ಹಂತವನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ (ತಾಪಮಾನವು >25℃ ಆಗಿರಬೇಕು) 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಸುಮಾರು 11,000 rpm (12,000 × g) ನಲ್ಲಿ ಸೂಪರ್ನಾಟಂಟ್ ಅನ್ನು ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮಾಡಿ.ಮೇಲಿನ ಜಲೀಯ ಹಂತವು ಡಿಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತದೆ ಆದರೆ ಕೆಳಗಿನ ನೀಲಿ ಎಣ್ಣೆಯುಕ್ತ ಹಂತದ ಪದರವು ಎಂಡೋಟಾಕ್ಸಿನ್ ಮತ್ತು ಇತರ ಕಲ್ಮಶಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತದೆ.ವರ್ಗಾಯಿಸಿಡಿಎನ್ಎ-ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಜಲೀಯ ಹಂತವು ಹೊಸ ಟ್ಯೂಬ್ಗೆ ಮತ್ತುಎಣ್ಣೆಯುಕ್ತ ಪದರವನ್ನು ತ್ಯಜಿಸಿ.
Δ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ತಾಪಮಾನವು 25℃ ಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ಇರಬೇಕು ಏಕೆಂದರೆ ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ ಹಂತದ ಬೇರ್ಪಡಿಕೆ ಮಾಡುವುದಿಲ್ಲತಾಪಮಾನವು ತುಂಬಾ ಕಡಿಮೆಯಿದ್ದರೆ ಸಂಭವಿಸುತ್ತದೆ.
Δ ಹಂತದ ಬೇರ್ಪಡಿಕೆ ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗದಿದ್ದರೆ, ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ತಾಪಮಾನವನ್ನು 30℃ ಗೆ ಸರಿಹೊಂದಿಸಬಹುದು ಮತ್ತುಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಸಮಯವನ್ನು 15 ನಿಮಿಷಕ್ಕೆ ಹೆಚ್ಚಿಸಬಹುದು.
Δ ಎಂಡೋಟಾಕ್ಸಿನ್ ಮತ್ತು ಇತರ ಕಲ್ಮಶಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ನೀಲಿ ಎಣ್ಣೆಯ ಪದರವನ್ನು ಹೀರಬೇಡಿ.
ಯಾಂತ್ರಿಕತೆ
ಪುನರುಜ್ಜೀವನ ಲೈಸಿಸ್ ನ್ಯೂಟ್ರಾಲೈಸೇಶನ್
◇ 7.5 ಮಿಲಿ ಬಫರ್ P1 ಸೇರಿಸಿ
◇ 7.5 ಮಿಲಿ ಬಫರ್ P2 ಸೇರಿಸಿ
◇ 7.5 ಮಿಲಿ ಬಫರ್ P4 ಸೇರಿಸಿ
ಎಂಡೋಟಾಕ್ಸಿನ್ ತೆಗೆಯುವಿಕೆ
◇ ಎಂಡೋಟಾಕ್ಸಿನ್ ಸ್ಕ್ಯಾವೆಂಜರ್‌ನ ಸೂಪರ್ನಾಟಂಟ್ ಪರಿಮಾಣದ 0. 1 ಪಟ್ಟು ಸೇರಿಸಿ
ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಮತ್ತು ವಾಷಿಂಗ್
◇ ಐಸೊಪ್ರೊಪನಾಲ್ನ ಪರಿಮಾಣದ 0.5 ಪಟ್ಟು ಸೇರಿಸಿ
◇ 10 ಮಿಲಿ ಬಫರ್ PW ಸೇರಿಸಿ
◇ 10 ಮಿಲಿ ಬಫರ್ PW ಸೇರಿಸಿ
ಎಲುಶನ್
◇ 1 - 2 ಮಿಲಿ ಬಫರ್ TB ಅಥವಾ ಎಂಡೋಟಾಕ್ಸಿನ್-ಮುಕ್ತ ddH2O ಸೇರಿಸಿ
