RTL ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್
RTL ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ ಒಂದು RNA ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್-ಅವಲಂಬಿತ DNA ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಆಗಿದ್ದು ಅದು 3'→5' ಎಕ್ಸೋನ್ಯೂಕ್ಲೀಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿರುವುದಿಲ್ಲ ಮತ್ತು RNase H ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ.ಈ ಕಿಣ್ವವು ಡಿಎನ್‌ಎಯ ಪೂರಕ ಎಳೆಯನ್ನು ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯನ್ನು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನಂತೆ ಬಳಸಬಹುದು, ಇದನ್ನು ಮೊದಲ-ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ ಸಿಡಿಎನ್‌ಎ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಗೆ ಅನ್ವಯಿಸಬಹುದು, ವಿಶೇಷವಾಗಿ ಆರ್ಟಿ-ಲ್ಯಾಂಪ್ (ಲೂಪ್-ಮಧ್ಯಸ್ಥ ಐಸೊಥರ್ಮಲ್ ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್).RTL ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ 1.0 ನೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ, ಸೂಕ್ಷ್ಮತೆಯು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಸುಧಾರಿಸಿದೆ, ಉಷ್ಣ ಸ್ಥಿರತೆ ಬಲವಾಗಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು 65 ° C ನಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯು ಹೆಚ್ಚು ಸ್ಥಿರವಾಗಿರುತ್ತದೆ.ಆರ್ಟಿಎಲ್ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ (ಗ್ಲಿಸರಾಲ್ ಮುಕ್ತ) ಅನ್ನು ಲೈಯೋಫೈಲೈಸ್ಡ್ ಸಿದ್ಧತೆಗಳು, ಲೈಯೋಫೈಲೈಸ್ಡ್ ಆರ್ಟಿ-ಲ್ಯಾಂಪ್ ಕಾರಕಗಳು ಇತ್ಯಾದಿಗಳನ್ನು ತಯಾರಿಸಲು ಬಳಸಬಹುದು.
ಘಟಕದ ವ್ಯಾಖ್ಯಾನ
ಒಂದು ಘಟಕವು ಪಾಲಿ(A)•oligo(dT)25 ಅನ್ನು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್-ಪ್ರೈಮರ್ ಆಗಿ ಬಳಸಿಕೊಂಡು 50 °C ನಲ್ಲಿ 20 ನಿಮಿಷಗಳಲ್ಲಿ 1 nmol dTTP ಯನ್ನು ಆಮ್ಲ- ಅವಕ್ಷೇಪಿತ ವಸ್ತುವಾಗಿ ಸಂಯೋಜಿಸುತ್ತದೆ.
ಘಟಕಗಳು
| ಘಟಕ | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ (ಗ್ಲಿಸರಾಲ್-ಫ್ರೀ) (15U/μL) | 0.1 ಮಿ.ಲೀ | 1 ಮಿ.ಲೀ | 10 ಮಿ.ಲೀ |
| 10×HC RTL ಬಫರ್ | 1.5 ಮಿ.ಲೀ | 4×1.5 ಮಿಲಿ | 5×10 ಮಿಲಿ |
| MgSO4 (100mM) | 1.5 ಮಿ.ಲೀ | 2×1.5 ಮಿಲಿ | 3×10 ಮಿಲಿ |
ಶೇಖರಣಾ ಸ್ಥಿತಿ
0 ° C ಗಿಂತ ಕಡಿಮೆ ಸಾರಿಗೆ ಮತ್ತು -25 ° C ~ -15 ° C ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಗುಣಮಟ್ಟ ನಿಯಂತ್ರಣ
- ಉಳಿದಿರುವ ಚಟುವಟಿಕೆEನ್ಯೂನ್ಯೂಕ್ಲೀಸ್:1 μg λDNA ಮತ್ತು 15 ಯೂನಿಟ್ RTL2.0 ಅನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ 50 μL ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯು 37 ℃ ನಲ್ಲಿ 16 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಕಾವು ಮಾಡಲಾದ ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್‌ನಿಂದ ಋಣಾತ್ಮಕ ನಿಯಂತ್ರಣವನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ.
- ಉಳಿದಿರುವ ಚಟುವಟಿಕೆಎಕ್ಸೋನ್ಯೂಕ್ಲೀಸ್:1 μg ಹಿಂದ್ Ⅲ ಜೀರ್ಣಗೊಂಡ λDNA ಮತ್ತು 15 ಯೂನಿಟ್ RTL2.0 ಅನ್ನು 37 ℃ ನಲ್ಲಿ 16 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಕಾವು ಹೊಂದಿರುವ 50 μL ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯು ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್‌ನಿಂದ ನಕಾರಾತ್ಮಕ ನಿಯಂತ್ರಣವನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ.
- ಉಳಿದಿರುವ ಚಟುವಟಿಕೆನಿಕೇಸ್:1 μg ಸೂಪರ್‌ಕಾಯಿಲ್ಡ್ pBR322 ಮತ್ತು 15 ಯೂನಿಟ್ RTL2.0 ಅನ್ನು 37 ° C ನಲ್ಲಿ 4 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಕಾವು ಹೊಂದಿರುವ 50 μL ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯು ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್‌ನಿಂದ ನಕಾರಾತ್ಮಕ ನಿಯಂತ್ರಣವನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ.
- ಉಳಿದಿರುವ ಚಟುವಟಿಕೆRNase:10 μL ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯು 0.48 μg MS2 RNA ಮತ್ತು 15 ಯೂನಿಟ್ RTL2.0 ಅನ್ನು 37 ° C ನಲ್ಲಿ 4 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡುವುದು ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್‌ನಿಂದ ನಕಾರಾತ್ಮಕ ನಿಯಂತ್ರಣವನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ.
- E. ಕೊಲಿ gDNA:ಜೊತೆ ಅಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆಇ.ಕೋಲಿನಿರ್ದಿಷ್ಟ HCD ಪತ್ತೆ ಕಿಟ್‌ಗಳು，15 RTL2.0 ಯೂನಿಟ್‌ಗಳು 1 ಕ್ಕಿಂತ ಕಡಿಮೆ ಹೊಂದಿರುತ್ತವೆE. ಕೊಲಿಜೀನೋಮ್.
ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಸೆಟಪ್
cDNA ಸಿಂಥೆಸಿಸ್ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್
| ಘಟಕಗಳು | ಸಂಪುಟ |
| ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ RNA a | ಐಚ್ಛಿಕ |
| ಒಲಿಗೊ(dT) 18~25(50uM) ಅಥವಾ ರಾಂಡಮ್ ಪ್ರೈಮರ್ ಮಿಶ್ರಣ(60uM) | 2 μL |
| dNTP ಮಿಕ್ಸ್ (10mM ಪ್ರತಿ) | 1 μL |
| RNase ಪ್ರತಿರೋಧಕ (40U/uL) | 0.5 μL |
| RTL ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ 2.0 (15U/uL) | 0.5 μL |
| 10×HC RTL ಬಫರ್ | 2 μL |
| ನ್ಯೂಕ್ಲೀಸ್ ಮುಕ್ತ ನೀರು | 20 μL ವರೆಗೆ |
ಟಿಪ್ಪಣಿಗಳು:
1) ಒಟ್ಟು RNAಯ ಶಿಫಾರಸು ಡೋಸೇಜ್ 1ng~1μg ಆಗಿದೆ
2) mRNAಯ ಶಿಫಾರಸು ಡೋಸೇಜ್ 50ng~100ng ಆಗಿತ್ತು
ಥರ್ಮೋ-ದಿನಚರಿಗಾಗಿ ಸೈಕ್ಲಿಂಗ್ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ:
| ತಾಪಮಾನ (°C) | ಸಮಯ |
| 25 °Ca | 5 ನಿಮಿಷಗಳು |
| 55 °C | 10 ನಿಮಿಷಗಳುb |
| 80 °C | 10 ನಿಮಿಷಗಳು |
ಟಿಪ್ಪಣಿಗಳು:
1) ರಾಂಡಮ್ ಪ್ರೈಮರ್ ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು ಬಳಸಿದರೆ, 25 ° C ನಲ್ಲಿ ಕಾವುಕೊಡುವ ಹಂತ.
2) ಟಾರ್ಗೆಟ್ ಪ್ರೈಮರ್ ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು ಬಳಸಿದರೆ, 10~30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 55 ° C ನಲ್ಲಿ ಕಾವು ಹಂತ.
RT-LAMP ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್
| ಘಟಕಗಳು | ಸಂಪುಟ | ಅಂತಿಮ ಏಕಾಗ್ರತೆ |
| ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಆರ್ಎನ್ಎ | ಐಚ್ಛಿಕ | ≥10 ಪ್ರತಿಗಳು |
| dNTP ಮಿಕ್ಸ್ (10mM) | 3.5 μL | 1.4 ಮಿ.ಮೀ |
| FIP/BIP ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು (25×) | 1 μL | 1.6 μM |
| F3/B3 ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು (25×) | 1 μL | 0.2 μM |
| LoopF/LoopB ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು (25×) | 1 μL | 0.4 μM |
| RNase ಇನ್ಹಿಬಿಟರ್ (40U/μL) | 0.5 μL | 20 U/ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ |
| RTL ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಟೇಸ್ 2.0 (15U/μL) | 0.5 μL | 7.5 U/ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ |
| Bst V2 DNA ಪಾಲಿಮರೇಸ್ (8U/μL) | 1 μL | 8 U/ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ |
| MgSO4 (100mM) | 1.5 μL | 6 mM (ಒಟ್ಟು 8 mM) |
| 10×HC RTL ಬಫರ್ (ಅಥವಾ 10×HC Bst V2 ಬಫರ್) | 2.5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| ನ್ಯೂಕ್ಲೀಸ್ ಮುಕ್ತ ನೀರು | 25 μL ವರೆಗೆ | - |
ಟಿಪ್ಪಣಿಗಳು:
1) ಸಂಗ್ರಹಿಸಲು ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ ಸುಳಿಯ ಮತ್ತು ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮೂಲಕ ಮಿಶ್ರಣ ಮಾಡಿ.1 ಗಂಟೆಗೆ 65 ° C ನಲ್ಲಿ ನಿರಂತರ ತಾಪಮಾನ ಕಾವು.
2) ಎರಡು ಬಫರ್‌ಗಳು ಪರಸ್ಪರ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸಬಲ್ಲವು ಮತ್ತು ಒಂದೇ ಸಂಯೋಜನೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ.
ಟಿಪ್ಪಣಿಗಳು
1.ಈ ಉತ್ಪನ್ನವು -20 °C ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಿದಾಗ ಬಿಳಿ ಘನವನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತದೆ.-20 ° C ನಿಂದ ಹೊರತೆಗೆಯಿರಿ ಮತ್ತು ಸುಮಾರು 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಐಸ್ನಲ್ಲಿ ಇರಿಸಿ.ಕರಗಿದ ನಂತರ, ಅದನ್ನು ಅಲುಗಾಡುವ ಮತ್ತು ಮಿಶ್ರಣ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ ಬಳಸಬಹುದು.
2.CDNA ಉತ್ಪನ್ನವನ್ನು -20 ° C ಅಥವಾ -80 ° C ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಬಹುದು ಅಥವಾ PCR ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಾಗಿ ತಕ್ಷಣವೇ ಬಳಸಬಹುದು.
3.RNase ಮಾಲಿನ್ಯವನ್ನು ತಡೆಗಟ್ಟಲು, ದಯವಿಟ್ಟು ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ಸ್ವಚ್ಛವಾಗಿಡಿ ಮತ್ತು ಕಾರ್ಯಾಚರಣೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಕ್ಲೀನ್ ಕೈಗವಸುಗಳು ಮತ್ತು ಮುಖವಾಡಗಳನ್ನು ಧರಿಸಿ.
