ಸಸ್ಯ ನೇರ ಪಿಸಿಆರ್ ಕಿಟ್
ಬೆಕ್ಕು ಸಂಖ್ಯೆ: HCR2020A
ಪ್ಲಾಂಟ್ ಡೈರೆಕ್ಟ್ ಪಿಸಿಆರ್ ಕಿಟ್ ಸಸ್ಯದ ಎಲೆಗಳು, ಬೀಜಗಳು ಇತ್ಯಾದಿಗಳ ನೇರ ವರ್ಧನೆಗೆ ಸೂಕ್ತವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಪಾಲಿಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಪಾಲಿಫಿನಾಲ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರದ ಸಸ್ಯ ಮಾದರಿಗಳ ಹೆಚ್ಚಿನ-ಥ್ರೋಪುಟ್ ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್‌ಗೆ ಬಳಸಬಹುದು.ನಿರ್ದೇಶಿತ ವಿಕಾಸದ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ ನೇರ ವರ್ಧನೆ DNA ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಸಸ್ಯಗಳಲ್ಲಿನ PCR ಪ್ರತಿರೋಧಕಗಳಿಗೆ ಉತ್ತಮ ಸಹಿಷ್ಣುತೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ.ಏತನ್ಮಧ್ಯೆ, ಇದು ಹೆಚ್ಚಿನ ವರ್ಧನೆಯ ಕಾರ್ಯಕ್ಷಮತೆಯನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು 5 kb ಒಳಗೆ DNA ತುಣುಕುಗಳ ವರ್ಧನೆಗೆ ಸೂಕ್ತವಾಗಿದೆ.ಕಿಟ್‌ನಲ್ಲಿರುವ ವಿಶಿಷ್ಟವಾದ ಲೈಸಿಸ್ ಬಫರ್ A ಅನ್ನು ತಾಜಾ ಅಥವಾ ಹೆಪ್ಪುಗಟ್ಟಿದ ಸಸ್ಯ ಅಂಗಾಂಶಗಳನ್ನು ಲೈಸ್ ಮಾಡಲು ಬಳಸಬಹುದು.ಇದು ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸಲು ಸುಲಭವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಲೈಸೇಟ್ ಅನ್ನು ಶುದ್ಧೀಕರಣವಿಲ್ಲದೆ ವರ್ಧನೆಗಾಗಿ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಆಗಿ ಬಳಸಬಹುದು.ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಘನೀಕರಣ ಮತ್ತು ಕರಗಿದ ನಂತರ ಕಚ್ಚಾ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿ ವರ್ಧಿಸಲು ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡುವ ರಕ್ಷಣಾತ್ಮಕ ಏಜೆಂಟ್‌ಗಳನ್ನು ಸಿಸ್ಟಮ್ ಒಳಗೊಂಡಿದೆ.2 × ಪ್ಲಾಂಟ್ ಡೈರೆಕ್ಟ್ ಮಾಸ್ಟರ್ ಮಿಕ್ಸ್ ವರ್ಧನೆ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಲು ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳನ್ನು ಮಾತ್ರ ಸೇರಿಸುವ ಅಗತ್ಯವಿದೆ, ಇದರಿಂದಾಗಿ ಪೈಪೆಟಿಂಗ್ ಕಾರ್ಯಾಚರಣೆಗಳನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪತ್ತೆ ಥ್ರೋಪುಟ್ ಮತ್ತು ಫಲಿತಾಂಶಗಳ ಪುನರುತ್ಪಾದನೆಯನ್ನು ಸುಧಾರಿಸುತ್ತದೆ.
ಘಟಕಗಳು
| ಘಟಕಗಳು | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 × ಪ್ಲಾಂಟ್ ಡೈರೆಕ್ಟ್ ಮಾಸ್ಟರ್ ಮಿಕ್ಸ್ | 1.25 ಮಿ.ಲೀ | 4×1.25 ಮಿಲಿ |
| ಪ್ಲಾಂಟ್ ಡೈರೆಕ್ಟ್ ಲೈಸಿಸ್ ಬಫರ್ ಎ | 5 ಮಿ.ಲೀ | 20 ಮಿ.ಲೀ |
| ಪ್ಲಾಂಟ್ ಡೈರೆಕ್ಟ್ ಲೈಸಿಸ್ ಬಫರ್ ಬಿ* | 5 ಮಿ.ಲೀ | 20 ಮಿ.ಲೀ |
*ಪ್ಲಾಂಟ್ ಡೈರೆಕ್ಟ್ ಲೈಸಿಸ್ ಬಫರ್ ಬಿ ಒಂದು ಐಚ್ಛಿಕ ಕಾರಕವಾಗಿದ್ದು, ಮಾದರಿಗಳ ಶೇಖರಣಾ ಸಮಯವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಲು ಸಸ್ಯ ನೇರ ಲೈಸಿಸ್ ಬಫರ್ ಎ ಅನ್ನು ತಟಸ್ಥಗೊಳಿಸಲು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ನೈಜ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ ಇದನ್ನು ಬಳಸಬಹುದು.
ಶೇಖರಣಾ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳು
2 × ಪ್ಲಾಂಟ್ ಡೈರೆಕ್ಟ್ ಮಾಸ್ಟರ್ ಮಿಕ್ಸ್, -30 ~ -15℃ ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ ಮತ್ತು ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಘನೀಕರಣ ಮತ್ತು ಕರಗುವಿಕೆಯನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಿ;ಪ್ಲಾಂಟ್ ಡೈರೆಕ್ಟ್ ಲೈಸಿಸ್ ಬಫರ್, -30 ~ -15℃ ಅಥವಾ 2 ~ 8℃ ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ.
ಪ್ರಯೋಗ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆ
ಮಾದರಿ ಸಂಸ್ಕರಣೆ–ಸಸ್ಯ ಎಲೆ
ನೇರ ವಿಧಾನ:ಎಳೆಯ ಎಲೆಗಳನ್ನು ಬಳಸಲು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ಸಣ್ಣ ಮತ್ತು ಏಕರೂಪದ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಪಡೆಯಲು 0.5 - 3 ಮಿಮೀ ಸ್ಥಿರ ವ್ಯಾಸವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ರಂಧ್ರ ಪಂಚ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿ, ತದನಂತರ ನೇರವಾಗಿ ಪಿಸಿಆರ್ ಸಿಸ್ಟಮ್ಗೆ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಸೇರಿಸಿ (50 μl ಸಿಸ್ಟಮ್ ಅನ್ನು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ).ಗಮನಿಸಿ, ಮಾದರಿಯು PCR ದ್ರಾವಣದಲ್ಲಿದೆ ಮತ್ತು ಟ್ಯೂಬ್ ಗೋಡೆಯ ವಿರುದ್ಧ ಅಲ್ಲ ಎಂದು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಿ.ಉದ್ದವಾದ ತುಣುಕುಗಳು ಮತ್ತು ಸಂಕೀರ್ಣ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ವರ್ಧಿಸಲು ನೇರ ಪಿಸಿಆರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿದರೆ, ಸಣ್ಣ ವ್ಯಾಸದ (0.5 - 1 ಮಿಮೀ) ಮಾದರಿಯನ್ನು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನಂತೆ ಬಳಸುವುದು ಉತ್ತಮ ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ಪಡೆಯಲು ಸಹಾಯ ಮಾಡುತ್ತದೆ.
ಗ್ರೈಂಡಿಂಗ್ ಲಿಸಿಸ್ ವಿಧಾನ:ಎಳೆಯ ಎಲೆಗಳನ್ನು ಬಳಸಲು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ಎಲೆಯ ಸಣ್ಣ ತುಂಡನ್ನು ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳಿ (ಸುಮಾರು 1 - 3 ಮಿಮೀ ವ್ಯಾಸ), ಅದನ್ನು 20 μl ಪ್ಲಾಂಟ್ ಡೈರೆಕ್ಟ್ ಲೈಸಿಸ್ ಬಫರ್ ಅಬ್‌ನಲ್ಲಿ ಇರಿಸಿ ಮತ್ತು ಅದನ್ನು ಸಾಧ್ಯವಾದಷ್ಟು ಪುಡಿಮಾಡಿ (ಈ ಹಂತವನ್ನು 100 μl ಪೈಪೆಟ್ ತುದಿಯಿಂದ ಎಲೆಯನ್ನು ಹಿಸುಕುವ ಮೂಲಕ ಮಾಡಬಹುದು. ಮಾದರಿಯನ್ನು ಮ್ಯಾಶ್ ಮಾಡಲು) .ದೊಡ್ಡ ಪ್ರಮಾಣದ ಎಲೆ ಅಂಗಾಂಶವನ್ನು ಬಳಸಿದರೆ (7 ಮಿಮೀ ಮೀರಬಾರದು), ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವ ಬಫರ್‌ನ ಪರಿಮಾಣವನ್ನು 50 μl ಗೆ ಹೆಚ್ಚಿಸಿ.ಎಲೆಗಳು ನೆಲದ ನಂತರ, ದ್ರಾವಣವು ಹಸಿರು ಬಣ್ಣದಲ್ಲಿ ಕಾಣಿಸಿಕೊಳ್ಳಬೇಕು.ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯ ನಂತರ, 1 μl ಸೂಪರ್ನಾಟಂಟ್ ಅನ್ನು ಪಿಸಿಆರ್ ಸಿಸ್ಟಮ್ಗೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಆಗಿ ಸೇರಿಸಿ.
ಥರ್ಮಲ್ ಲೈಸಿಸ್ ವಿಧಾನ:ಎಳೆಯ ಎಲೆಗಳನ್ನು ಬಳಸಲು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ಎಲೆಯ ಸಣ್ಣ ತುಂಡನ್ನು ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳಿ (ಸುಮಾರು 1 - 3 ಮಿಮೀ ವ್ಯಾಸದಲ್ಲಿ), ಅದನ್ನು 20 μl ಪ್ಲಾಂಟ್ ಡೈರೆಕ್ಟ್ ಲೈಸಿಸ್ ಬಫರ್ A ನಲ್ಲಿ ಇರಿಸಿ ಮತ್ತು 5 - 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಅದನ್ನು 95 ° C ನಲ್ಲಿ ಬಿಸಿ ಮಾಡಿ.ಲೈಸ್ ಮಾಡಲು ಕಷ್ಟಕರವಾದ ಎಲೆಗಳಿಗೆ (20 ನಿಮಿಷಗಳಿಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿಲ್ಲ) ಲಿಸಿಸ್ ಸಮಯವನ್ನು ಸೂಕ್ತವಾಗಿ ವಿಸ್ತರಿಸಬಹುದು.ದೊಡ್ಡ ಪ್ರಮಾಣದ ಎಲೆ ಅಂಗಾಂಶವನ್ನು ಬಳಸಿದರೆ (7 ಮಿಮೀ ಮೀರಬಾರದು), ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವ ಬಫರ್‌ನ ಪರಿಮಾಣವನ್ನು 50 μl ಗೆ ಹೆಚ್ಚಿಸಿ.ಬಿಸಿ ಮಾಡಿದ ನಂತರ, ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮಾಡಿ ಮತ್ತು ಪಿಸಿಆರ್ ಸಿಸ್ಟಮ್ಗೆ 1 μl ಸೂಪರ್ನಾಟಂಟ್ ಅನ್ನು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಬ್ ಆಗಿ ಸೇರಿಸಿ.
ಮಾದರಿ ಸಂಸ್ಕರಣೆ- ಸಸ್ಯ ಬೀಜ
ಗ್ರೈಂಡಿಂಗ್ ಲಿಸಿಸ್ ವಿಧಾನ:5 ಮಿಮೀ ವ್ಯಾಸವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಬೀಜಗಳನ್ನು ಕತ್ತರಿಸಲು ಸ್ಕಾಲ್ಪೆಲ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿ, ಅವುಗಳನ್ನು 100 μl ಪ್ಲಾಂಟ್ ಡೈರೆಕ್ಟ್ ಲೈಸಿಸ್ ಬಫರ್ A ಗೆ ಸೇರಿಸಿ ಮತ್ತು ಮಾದರಿಯನ್ನು ಪೈಪೆಟ್ ಟಿಪ್ ಅಥವಾ ಇತರ ಉಪಕರಣಗಳೊಂದಿಗೆ ಪುಡಿಮಾಡಿ.ಸುಳಿಯನ್ನು ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ ಮತ್ತು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 3 - 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ನಿಲ್ಲಲು ಬಿಡಿ.ಬೀಜದ ಮಾದರಿಯು ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವ ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ ಮುಳುಗಿರುವುದನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಿ.ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯ ನಂತರ, ಪಿಸಿಆರ್ ಸಿಸ್ಟಮ್ಗೆ 1 μl ಸೂಪರ್ನಾಟಂಟ್ ಅನ್ನು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನಂತೆ ಸೇರಿಸಿ.
ಥರ್ಮಲ್ ಲೈಸಿಸ್ ವಿಧಾನ:5 ಮಿಮೀ ವ್ಯಾಸವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಬೀಜಗಳನ್ನು ಕತ್ತರಿಸಲು ಚಿಕ್ಕಚಾಕು ಬಳಸಿ, ಅವುಗಳನ್ನು 100 μl ಪ್ಲಾಂಟ್ ಡೈರೆಕ್ಟ್ ಲೈಸಿಸ್ ಬಫರ್ A ಗೆ ಸೇರಿಸಿ ಮತ್ತು 95 ° C ನಲ್ಲಿ 5 - 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಬಿಸಿ ಮಾಡಿ.ಲೈಸ್ ಮಾಡಲು ಕಷ್ಟಕರವಾದ ಎಲೆಗಳಿಗೆ (30 ನಿಮಿಷಗಳಿಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿಲ್ಲ) ಲಿಸಿಸ್ ಸಮಯವನ್ನು ಸೂಕ್ತವಾಗಿ ವಿಸ್ತರಿಸಬಹುದು.ಬಿಸಿ ಮಾಡಿದ ನಂತರ, ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮಾಡಿ ಮತ್ತು ಪಿಸಿಆರ್ ಸಿಸ್ಟಮ್ಗೆ 1 μl ಸೂಪರ್ನಾಟಂಟ್ ಅನ್ನು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಬ್ ಆಗಿ ಸೇರಿಸಿ.
ಎ.ಸೂಕ್ತವಾದ ಗಾತ್ರದ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಕತ್ತರಿಸಲು ಕತ್ತರಿ ಅಥವಾ ಇತರ ಸಾಧನಗಳನ್ನು ಸಹ ಬಳಸಬಹುದು;ಪಂಚ್ ಅಥವಾ ಕತ್ತರಿಗಳನ್ನು ಮರುಬಳಕೆ ಮಾಡಿದರೆ, ಮಾದರಿಗಳ ನಡುವೆ ಅಡ್ಡ-ಮಾಲಿನ್ಯವನ್ನು ತಡೆಗಟ್ಟಲು ಪ್ರತಿ ಬಳಕೆಯ ಮೊದಲು ಅವುಗಳನ್ನು 2% ಸೋಡಿಯಂ ಹೈಪೋಕ್ಲೋರೈಟ್ ದ್ರಾವಣದಿಂದ ಸ್ವಚ್ಛಗೊಳಿಸಬೇಕು.
ಬಿ.ಪ್ಲಾಂಟ್ ಡೈರೆಕ್ಟ್ ಲೈಸಿಸ್ ಬಫರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸುವ ಮೊದಲು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಕರಗಿದೆ ಎಂದು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಿ.ಬಫರ್ ಸ್ನಿಗ್ಧತೆಯಿಂದ ಕೂಡಿದ್ದರೆ ಅಥವಾ ಅವಕ್ಷೇಪಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿದ್ದರೆ, ಬಳಕೆಗೆ ಮೊದಲು ಅದನ್ನು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಕರಗಿಸಲು ಅದನ್ನು 37℃ ನಲ್ಲಿ ಬಿಸಿಮಾಡಬಹುದು.
ಸಿ.ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯಲ್ಲಿನ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನ ಪರಿಮಾಣವನ್ನು ಸಸ್ಯದ ವಸ್ತುಗಳ ಪರಿಮಾಣದಲ್ಲಿನ ವ್ಯತ್ಯಾಸಕ್ಕೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ ಸರಿಹೊಂದಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ಸೇರಿಸಲಾದ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಬಹುದು.
ಸಸ್ಯ ನೇರ ಲೈಸಿಸ್ ಬಫರ್
ಈ ಉತ್ಪನ್ನದಲ್ಲಿ ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಪ್ಲಾಂಟ್ ಡೈರೆಕ್ಟ್ ಲೈಸಿಸ್ ಬಫರ್ A ಅನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಸ್ಯ ಅಂಗಾಂಶಗಳ ಜೀನೋಮ್ ಅನ್ನು ಬಿಡುಗಡೆ ಮಾಡಲು ಕಟ್ಟುನಿಟ್ಟಾಗಿ ಹೊಂದುವಂತೆ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು 4℃ ನಲ್ಲಿ ಕಚ್ಚಾ ಸಸ್ಯಗಳ ಅಲ್ಪಾವಧಿಯ ಸಂಗ್ರಹಣೆಗೆ ಸೂಕ್ತವಾಗಿದೆ.ಮಾದರಿಯನ್ನು ದೀರ್ಘಕಾಲದವರೆಗೆ ಸಂಗ್ರಹಿಸಬೇಕಾದರೆ (ಉದಾ, 1 - 2 ತಿಂಗಳುಗಳು), ಸೂಪರ್ನಾಟಂಟ್ ಅನ್ನು ಹೊಸ EP ಟ್ಯೂಬ್‌ಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಲು ಮತ್ತು ಅದನ್ನು -20℃ ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲು ಸೂಚಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಹೆಚ್ಚು ಸ್ಥಿರವಾಗಿ ಶೇಖರಿಸಿಡಲು, ವರ್ಗಾಯಿಸಲಾದ ಸೂಪರ್‌ನಾಟಂಟ್‌ಗೆ ಪ್ಲಾಂಟ್ ಡೈರೆಕ್ಟ್ ಲೈಸಿಸ್ ಬಫರ್ B ಯ ಸಮಾನ ಪರಿಮಾಣವನ್ನು ಸೇರಿಸಿ, ಚೆನ್ನಾಗಿ ಮಿಶ್ರಣ ಮಾಡಿ ಮತ್ತು -20℃ ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ.ಸ್ಥಿರ ಶೇಖರಣಾ ಸಮಯವು ಸಸ್ಯ ಮಾದರಿಗಳು ಮತ್ತು ರಾಜ್ಯಗಳೊಂದಿಗೆ ಬದಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ವ್ಯವಸ್ಥೆ
| ddH2O | 20.0 µl ಗೆ | 50.0 µl ಗೆ |
| 2 × ಪ್ಲಾಂಟ್ ಡೈರೆಕ್ಟ್ ಮಾಸ್ಟರ್ ಮಿಕ್ಸ್a | 10.0 µl | 25.0 µ |
| ಪ್ರೈಮರ್ 1 (10 µM) | 0.8 µl | 2.0 µl |
| ಪ್ರೈಮರ್ 2 (10 µM)b | 0.8 µl | 2.0 µl |
| ಸಸ್ಯ ಎಲೆ / ಕಚ್ಚಾ ಸಾರ ಮಾದರಿ(ಮಾದರಿ ಸಂಸ್ಕರಣೆಯನ್ನು ನೋಡಿ) | 0.5 – 3 ಮಿಮೀ ಲೀಫ್ ಡಿಸ್ಕ್/x µl | 0.5 – 3 ಮಿಮೀ ಲೀಫ್ ಡಿಸ್ಕ್/x µl |
ಎ.ಇದು Mg ಅನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತದೆ2+2 mM ನ ಅಂತಿಮ ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ.
ಬಿ.ಪ್ರತಿ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗೆ 0.4μM ನ ಅಂತಿಮ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಬಳಸಲು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ಅತಿಯಾದ ಬಳಕೆಯು ಹೆಚ್ಚಿದ ಅನಿರ್ದಿಷ್ಟ ವರ್ಧನೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ.
ಸಿ.ಬಳಸಿದ ಮಾದರಿಯ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ನೈಜ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ ಸರಿಹೊಂದಿಸಬಹುದು.ಕಚ್ಚಾ ಲೈಸ್ಡ್ ಮಾದರಿಯ ಒಂದು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾದ ಮೊತ್ತವನ್ನು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಒಟ್ಟು ಪರಿಮಾಣದ 2% - 20% ನಡುವೆ ಸರಿಹೊಂದಿಸಬಹುದು.ಹೆಚ್ಚಿನ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಬಳಸುವುದರಿಂದ ವರ್ಧನೆಯ ವೈಫಲ್ಯಕ್ಕೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು.
ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಕಾರ್ಯಕ್ರಮ
| ಹಂತಗಳು | ತಾಪಮಾನ | ಸಮಯ |
| ಆರಂಭಿಕ ಡಿನಾಟರೇಶನ್ | 98℃ | 5 ನಿಮಿಷ |
| ಡಿನಾಟರೇಶನ್ | 95℃ | 10 ಸೆ |
| ಅನೆಲಿಂಗ್ | 58 ~ 72℃ | 15 ಸೆ |
| ವಿಸ್ತರಣೆ | 72℃ | 30 ಸೆ |
| ಅಂತಿಮ ವಿಸ್ತರಣೆ | 72℃ | 5 ನಿಮಿಷ |
ಎ.ಇನಿಶಿಯಲ್ ಡಿನಾಟರೇಶನ್ (98℃, 5 ನಿಮಿಷ) ಸಸ್ಯ ಅಂಗಾಂಶದ ಲೈಸಿಸ್ ಅನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸುತ್ತದೆ, ಪಿಸಿಆರ್ ವರ್ಧನೆಗಾಗಿ ಬಳಸಬಹುದಾದ ಜೀನೋಮಿಕ್ ಡಿಎನ್ಎ ಬಿಡುಗಡೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ.ಸಮಯವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಬೇಡಿ ಅಥವಾ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಬೇಡಿ.
ಬಿ.ಪ್ರೈಮರ್ Tm ಮೌಲ್ಯಕ್ಕೆ ಸಮನಾಗಿ ಅಥವಾ Tm ಮೌಲ್ಯಕ್ಕಿಂತ 2 ~ 4℃ ಹೆಚ್ಚಿನದನ್ನು ಹೊಂದಿಸಲು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ಈ ಉತ್ಪನ್ನದಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾದ ನೇರ ವರ್ಧನೆ DNA ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಸಾಂಪ್ರದಾಯಿಕ Taq DNA ಪಾಲಿಮರೇಸ್‌ಗಿಂತ ಭಿನ್ನವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನಕ್ಕೆ ವಿಶೇಷ ಅವಶ್ಯಕತೆಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ; ಹೆಚ್ಚಿನ ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನದ ಬಳಕೆಯು ಅನಿರ್ದಿಷ್ಟ ವರ್ಧನೆಯನ್ನು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಯನ್ನು ಸುಧಾರಿಸುತ್ತದೆ.ಸಂಕೀರ್ಣ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಿಗಾಗಿ, ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಸರಿಹೊಂದಿಸುವ ಮೂಲಕ ಮತ್ತು ವಿಸ್ತರಣೆಯ ಸಮಯವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುವ ಮೂಲಕ ಸಮರ್ಥ ವರ್ಧನೆಯನ್ನು ಸಾಧಿಸಬಹುದು.
ಸಿ.ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಉತ್ಪನ್ನದ ಉದ್ದವು ≤1 kb ಆಗಿದ್ದರೆ, ವಿಸ್ತರಣೆಯ ಸಮಯವನ್ನು 30 ಸೆಕೆಂಡ್/ಕೆಬಿಗೆ ಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆ;ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಉತ್ಪನ್ನದ ಉದ್ದವು >1 kb ಆಗಿದ್ದರೆ, ವಿಸ್ತರಣೆಯ ಸಮಯವನ್ನು 60 ಸೆಕೆಂಡ್/ಕೆಬಿಗೆ ಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಡಿ.ಸಂಕೀರ್ಣ ಮಾದರಿಗಳು ಅಥವಾ ಕಡಿಮೆ ವರ್ಧನೆಯ ಇಳುವರಿ ಹೊಂದಿರುವ ಮಾದರಿಗಳಿಗೆ, ಚಕ್ರಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಸೂಕ್ತವಾಗಿ 40 -50 ಚಕ್ರಗಳಿಗೆ ಹೆಚ್ಚಿಸಬಹುದು.
ಅರ್ಜಿಗಳನ್ನು
ಸಸ್ಯ ಅಂಗಾಂಶಗಳ ನೇರ ವರ್ಧನೆ ಮತ್ತು ಪಾಲಿಸ್ಯಾಕರೈಡ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಪಾಲಿಫಿನಾಲ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರದ ಸಸ್ಯ ಮಾದರಿಗಳ ಹೆಚ್ಚಿನ-ಥ್ರೋಪುಟ್ ಸ್ಕ್ರೀನಿಂಗ್‌ಗೆ ಇದು ಅನ್ವಯಿಸುತ್ತದೆ.
ಟಿಪ್ಪಣಿಗಳು
ಸಂಶೋಧನಾ ಬಳಕೆಗೆ ಮಾತ್ರ.ರೋಗನಿರ್ಣಯ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗಳಲ್ಲಿ ಬಳಕೆಗೆ ಅಲ್ಲ.
1. ಕಚ್ಚಾ ಸಸ್ಯ ವರ್ಧನೆ ಅಥವಾ ನೇರ ವರ್ಧನೆಗಾಗಿ, ಸಿಸ್ಟಮ್, ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಕಾರ್ಯಾಚರಣೆಗಳು ಸರಿಯಾಗಿವೆಯೆ ಎಂದು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ಪ್ರಯೋಗವನ್ನು ಪ್ರಾರಂಭಿಸುವ ಮೊದಲು ಧನಾತ್ಮಕ ನಿಯಂತ್ರಣವಾಗಿ ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ ಜೀನೋಮಿಕ್ DNA ಅನ್ನು ಬಳಸಲು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.
2. ಈ ಕಿಟ್‌ನಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾದ ನೇರ ವರ್ಧನೆಯ ಡಿಎನ್ಎ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಬಲವಾದ ಪ್ರೂಫ್ ರೀಡಿಂಗ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ.TA ಕ್ಲೋನಿಂಗ್ ಮಾಡಬೇಕಾದರೆ, ಅಡೆನೈನ್ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸುವ ಮೊದಲು ಡಿಎನ್ಎ ಅನ್ನು ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಲು ಸೂಚಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
3. ಪ್ರೈಮರ್ ವಿನ್ಯಾಸ ಮಾರ್ಗದರ್ಶನ:
ಎ.ಪ್ರೈಮರ್‌ನ 3′ ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ ಕೊನೆಯ ಬೇಸ್ G ಅಥವಾ C ಆಗಿರಬೇಕು ಎಂದು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.
ಬಿ.ಪ್ರೈಮರ್‌ನ 3′ ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ ಕೊನೆಯ 8 ಬೇಸ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಸತತ ಹೊಂದಾಣಿಕೆಗಳನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಬೇಕು.ಸಿ.ಪ್ರೈಮರ್‌ನ 3′ ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ ಹೇರ್‌ಪಿನ್ ರಚನೆಗಳನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಿ.
ಡಿ.ಫಾರ್ವರ್ಡ್ ಪ್ರೈಮರ್ ಮತ್ತು ರಿವರ್ಸ್ ಪ್ರೈಮರ್‌ನ Tm ಮೌಲ್ಯದಲ್ಲಿನ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳು 1℃ ಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿರಬಾರದು ಮತ್ತು Tm ಮೌಲ್ಯವನ್ನು 60 ~ 72℃ ಗೆ ಸರಿಹೊಂದಿಸಬೇಕು (Tm ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಲೆಕ್ಕಾಚಾರ ಮಾಡಲು ಪ್ರೈಮರ್ ಪ್ರೀಮಿಯರ್ 5 ಅನ್ನು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ).
ಇ.ಪ್ರೈಮರ್ Tm ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಲೆಕ್ಕಾಚಾರ ಮಾಡುವಾಗ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಹೊಂದಿಕೆಯಾಗದ ಹೆಚ್ಚುವರಿ ಪ್ರೈಮರ್ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ಸೇರಿಸಬಾರದು.
f.ಪ್ರೈಮರ್‌ನ GC ವಿಷಯವು 40% -60% ಆಗಿರಬೇಕು ಎಂದು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.
ಜಿ.ಪ್ರೈಮರ್‌ನಲ್ಲಿ A, G, C ಮತ್ತು T ಗಳ ಒಟ್ಟಾರೆ ವಿತರಣೆಯು ಸಾಧ್ಯವಾದಷ್ಟು ಸಮವಾಗಿರಬೇಕು.ಹೆಚ್ಚಿನ GC ಅಥವಾ AT ವಿಷಯಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಪ್ರದೇಶಗಳನ್ನು ಬಳಸುವುದನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಿ.
ಗಂ.ಪ್ರೈಮರ್‌ನೊಳಗೆ ಅಥವಾ ಎರಡು ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ನಡುವೆ 5 ಅಥವಾ ಹೆಚ್ಚಿನ ಬೇಸ್‌ಗಳ ಪೂರಕ ಅನುಕ್ರಮಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಿ ಮತ್ತು ಎರಡು ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ 3′ ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ 3 ಅಥವಾ ಹೆಚ್ಚಿನ ಬೇಸ್‌ಗಳ ಪೂರಕ ಅನುಕ್ರಮಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಿ.
i.ಅನಿರ್ದಿಷ್ಟ ವರ್ಧನೆ ತಡೆಯಲು ಪ್ರೈಮರ್‌ನ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಪರಿಶೀಲಿಸಲು NCBI BLAST ಕಾರ್ಯವನ್ನು ಬಳಸಿ.
